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含硒纳米粒子的鼻腔递送对颞叶癫痫大鼠海马P-gp表达的影响及神经保护作用的研究认领

作者：

赵惟萱

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

第一部分:P-gp单克隆抗体修饰含硒纳米粒子的鼻腔递送系统构建及表征目的:构建含硒纳米粒子(SeNPs)及P-gp单克隆抗体修饰含硒纳米粒子的靶向递送系统(P-gp@SeNPs),并对其性能进行初步表征,为下文的研究提供基础。材料与方法:取定量亚硒酸、PEG溶液混合构建SeNPs;之后将SeNPs与P-gp单克隆抗体进行混合,冻干获得样品,溶解后洗涤,得到P-gp@SeNPs;分别通过紫外系数光谱法、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射法(DLS)以及带毒平板法对SeNPs、P-gp@SeNPs两组物质的均匀度、结构及抗菌性能进行测定。结果:SeNPs在紫外光谱分析中210 nm到259 nm处存在两个特征吸收峰,当其在SeNPs在修饰了 P-gp单克隆抗体后期吸收峰发生了蓝移,其特征峰发生于6 nm处;TEM结果显示,SeNPs、P-gp@SeNPs样品颗粒性状表现均体现出球形的形状,粒径较为均一,平均粒径为61.7nm;P-gp单克隆抗体在其硒纳米表面所负载的浓度为2.55 mg/mL;P-gp@SeNPs样品对金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌具有较好的抑菌效果,整体上二者的抑菌率可以达到100%左右。结论:本部分成功制备了粒径较小、分散均匀的P-gp@SeNPs样本,样品稳定性及抑菌性均较高,有望成为一种新型的高效物质,为下文的研究提供基础。第二部分:含硒纳米粒子鼻腔递送对颞叶癫痫大鼠海马组织P-gp表达水平影响的研究目的:P-gp@SeNPs鼻腔递送系统的构建以及其对颞叶癫痫大鼠海马组织中P-gp表达趋势影响的研究。材料与方法:(1)构建大鼠海人酸杏仁核点燃模型(TLE大鼠),分别测定造模术后1d、7d、14d及30d大鼠海马组织P-gp表达水平(WB),选择最高点(30d)作为后续实验给药时间。经鼻腔给予iFlour594标记的P-gp@SeNPs 6小时后取脑切片,进行微血管内皮(GLUT1)特异染色;(2)设置Sham组(空白对照组)、Model组(颞叶癫痫大鼠组)、SeNPs(口服)组及P-gp@SeNPs(鼻腔递送)组;确定各组大鼠行为学发作;Western-blot、免疫组化检测各组大鼠脑组织内P-gp蛋白表达。结果:(1)随着术后时间的延长,大鼠脑组织内P-gp蛋白表达逐渐提升(P<0.05);微血管内皮(GLUT1)特异染色结果显示,P-gp@SeNPs在正常大鼠海马组织中与微血管内皮细胞存在共定位,提示P-gp修饰的SeNPs经鼻腔入脑后能有效富集在微血管内皮细胞,即P-gp的主要表达区域。(2)与Sham组相比,TLE大鼠模型构建可以提升海马组织内P-gp蛋白表达,干预可以下调TLE大鼠海马组织内P-gp蛋白表达(P<0.05);经P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs的鼻腔递送进一步抑制海马组织内P-gp表达(P<0.05)。结论:(1)大鼠进行杏仁核海人酸注射后30d内,术侧海马组织内P-gp表达水平呈现持续上升趋势。(2)SeNPs的口服给予以及P-gp@SeNPs的鼻腔递送显著抑制了癫痫发作后P-gp的过表达。第三部分:含硒纳米粒子靶向递送对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用研究材料与方法:设置Sham组(空白对照组)、Model组(TLE大鼠组)、SeNPs组及P-gp@SeNPs组;确定各组大鼠行为学发作;通过尼氏染色、HE染色分析各组大鼠海马病理改变;ELISA检测各组大鼠海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)浓度水平;TUNEL法检测各组大鼠海马组织细胞凋亡程度;Western-blot及RT-qPCR法分析各组大鼠组织内细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase3、Bax浓度表达。结果:对照组大鼠海马组织结构以及形态基本正常,海马细胞的染色形态均匀,排列整齐,细胞核以及细胞核仁的大小均基本正常,尼氏小体数量较多;TLE模型构建后,大鼠海马组织神经元细胞发生不同程度肿胀,细胞出现透明空泡化,核以及细胞浆的着色欠均匀,细胞结构与形态紊乱,同时神经元细胞的体积逐渐缩小,固缩深染,尼氏小体数量减少;硒纳米粒子(SeNPs)干预可以改善大鼠海马组织病理形态,细胞形态及结构均较模型组有所恢复,尼氏小体数量增加;经P-gp单克隆抗体修饰后,海马组织的病理形态得到进一步的提升,神经元的着色更加均匀,形态更加规整,尼氏小体数量进一步提升。与Sham组相比,TLE大鼠模型构建可以提升海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)及 Caspase3、Bax 表达,降低 GR、CAT、GPx、SOD、Bcl-2 水平(P<0.05);与Model组相比,硒纳米粒子(SeNPs)干预可以下调TLE大鼠海马组织内炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)水平及 Caspase3、Bax 表达,上调 GR、CAT、GPx、SOD、Bcl-2水平(P<0.05);经P-gp单克隆抗体修饰后,硒纳米粒子(SeNPs)干预进一步抑制海马组织炎性因子(NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α)、Caspase3、Bax 表达,提升 GR、CAT、GPx、SOD 及 Bcl-2水平(P<0.05)。结论:(1)对杏仁核KA注射癫痫大鼠进行SeNPs的递送通过减轻癫痫发作导致的氧化应激抑制神经炎症的发展,减轻大鼠海马组织神经元凋亡,发挥神经保护作用。(2)P-gp@SeNPs的鼻腔递送绕过血脑屏障直接入脑并向P-gp高表达区域的靶向富集进一步增强神经保护作用。第四部分:含硒纳米粒子鼻腔递送对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用机制研究目的:探究SeNPs、P-gp@SeNPs递送系统对颞叶癫痫大鼠的神经保护作用的分子机制。材料与方法:(1)构建大鼠海人酸杏仁核点燃模型(TLE大鼠),设置Sham组(空白对照组)、Model组(TLE大鼠组)、SeNPs组及P-gp@SeNPs组;Western-blot检测各组大鼠海马组织内MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK1/2表达水平。(2)采用MAPK信号通路抑制剂VX-702干预模型组大鼠,设置Model组、VX-702 组、SeNPs 组、P-gp@SeNPs 组、P-gp@SeNPs+VX-702 组;Western-blot检测各组大鼠海马组织内MAPK信号通路关键蛋白p-p38、p-JNK、p-ERK1/2表达水平;确定P-gp@SeNPs靶向递送系统对大鼠海马组织内MAPK信号通路的抑制作用。结果:(1)与Sham组相比,TLE大鼠模型建立后,海马组织内p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达提升(P<0.05);SeNPs的干预可以降低p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs抑制MAPK信号通路活性与之接近(P>0.05)。(2)与Model组相比,MAPK信号通路抑制剂的干预可以明显降低海马组织内p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);SeNPs的干预可以降低p-p38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达(P<0.05);将P-gp单克隆抗体修饰后,SeNPs抑制MAPK信号通路活性与之接近(P>0.05);P-gp-SeNPs与VX-702联合可以进一步降低 p-p38、p-JNK、p-ERK1/2 的水平(P<0.05)。结论:SeNPs可抑制MAPK信号通路的活性,进而缓解TLE病理进展,为临床的研究提供基础。

摘要译文

关键词：

癫痫; 纳米硒; P-gp; 鼻腔递送; 神经保护

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

孟红梅

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27162/d.cnki.gjlin.2024.000803