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肠外致病性大肠杆菌RS218抵抗宿主限铁环境和补体攻击的机制认领

作者：

孙玉

学位授予单位：

南京农业大学

摘要：

肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是人类和畜禽重要感染性病原,能够引起机体的系统性感染,包括脑膜炎、尿路感染、菌血症、败血症等,危害人和动物健康,造成公共卫生隐患,带来严重经济负担。与共生性大肠杆菌相比,ExPEC编码一系列毒力因子,来保证其能够在宿主体内逆境中生存和引发感染。机体的先天免疫系统在识别和清除入侵微生物方面至关重要。宿主内的低铁环境限制病原菌对铁这一必需营养元素的摄取,阻碍病原在宿主中的定植和存活。补体系统是先天免疫反应的核心组成部分,不仅能够直接裂解病原菌,还能通过免疫调理作用促进巨噬细胞对病原的吞噬。ExPEC包括尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli,UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(neonatal meningitis E.coli,NMEC)、败血症型大肠杆菌(Septicemic E.coli)、猪源肠外致病性大肠杆菌和禽致病性大肠杆菌(Avian PathogenicE.coli,APEC)。不同致病型ExPEC在血清型、毒力因子、致病机制等方面相似性极高。ExPEC能克服营养限制、绕过宿主的补体攻击,导致宿主的系统性感染。探索ExPEC逃逸铁限制性环境和补体攻击的机制有助于进一步阐明细菌的致病机制,为大肠杆菌的防控提供理论依据。 1.ExPEC结合转铁蛋白利用铁对其生长和存活的影响转铁蛋白(TF)是宿主中重要的含铁蛋白,一些病原菌能够通过结合TF来获取铁。研究发现ExPECRS218菌株可以利用全载铁TF(holo-TF)中的铁其在限制性培养基、热灭活血清和巨噬细胞中的生长和存活能力。胶体金电镜和荧光检测发现ExPEC RS218菌株能够在细菌表面结合holo-TF,不结合apo-TF。荧光检测也发现巨噬细胞THP-1中的ExPEC也能结合胞内的holo-TF。通过钙黄绿素荧光淬灭试验和ELISA检测,确认ExPEC菌株RS218能够摄取holo-TF中的铁。Westernblotting未在ExPEC菌株的胞质中检测到TF,表明ExPEC不会将holo-TF摄取到胞质。以上结果表明ExPEC菌株RS218在细菌表面结合holo-TF并摄取其中的铁,为ExPEC表面TF结合蛋白的研究奠定基础。 2.EFG结合holo-TF的机制研究本研究利用生物素pull-down、双向电泳和质谱分析,筛选并鉴定ExPEC菌株RS218表面的holo-TF受体。结果发现延伸因子G(EFG)是一种潜在的TF结合蛋白。通过Far-Western blotting、ELISA板结合试验、生物素pull-down和蛋白抑制试验,确认EFG与holo-TF的互作。EFG能够特异性结合holo-TF而不结合apo-TF。通过检测holo-TF与EFG互作后的apo-TF的生成,发现EFG并能够释放其中的铁。通过构建EFG结构域缺失或片段缺失的重组蛋白,确认EFG的N端结构域具有结合holo-TF能力,C端结构域则具有释放TF中铁的功能。利用外源蛋白表面表达载体,将EFG及其结构域外膜表达在非致病性大肠杆菌BL21中,在整菌水平上证明EFG及其结构域的结合holo-TF和释放holo-TF中的铁两个功能。EFG在细菌表面的过表达能显著增加细菌与巨噬细胞中holo-TF的结合,并显著提高细菌在巨噬细胞内的存活能力。本研究结果揭示ExPEC菌株RS218利用EFG参与铁获取的新机制,有助于揭示ExPEC抵抗营养免疫的分子机制。 3.EFTu结合holo-TF的机制研究除 EFG 外,ExPEC 菌株 RS218 的延伸因子 Tu(Elongation factor Tu,EFTu)也被筛选为潜在的holo-TF结合蛋白。本研究利用免疫双荧光检测、菌落印记和Western blotting 确定 EFTu 是 ExPEC 的表面蛋白。利用 Far-Western blotting、ELISA板结合试验和蛋白抑制试验确认EFTu与holo-TF特异性结合,同时ELISA板结合试验确认EFTu不结合apo-TF。通过检测holo-TF与EFTu互作后的apo-TF的生成,发现EFTu并能够释放holo-TF的铁。构建EFTu结构域缺失的重组蛋白,发现EFTu的每一个结构域都参与结合holo-TF以及释放TF中的铁。利用表面过表达载体发现EFTu在非致病性大肠杆菌中的过表达不仅增强细菌结合holo-TF的能力,还促进细菌对holo-TF中的铁的吸收。血清存活试验表明EFTu显著提高大肠杆菌在热灭活人血清中的存活率,这种促进作用与holo-TF的添加剂量呈正相关,但与apo-TF无关。本研究揭示EFTu在结合holo-TF以促进细菌吸收铁方面的新功能,表明EFTu是ExPEC的毒力相关因子。本研究也有助于揭示ExPEC的铁获取机制和致病机制。 4.ExPEC结合H因子逃逸补体攻击的机制研究 H因子(Factor H,FH)是补体系统中一种重要的调节蛋白。本研究发现,ExPEC菌株RS218可与血清中的FH结合。采用脱硫生物素pull-down与液相色谱-串联质谱相结合的方法,对ExPEC的FH结合膜蛋白进行鉴定。鉴定结果显示多个碳水化合物代谢酶(Carbohydrate metabolic enzymes,CMEs),包括乙酸激酶、果糖-二磷酸醛缩酶、延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基、L-乳酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶和丙酮酸脱氢酶均为FH结合蛋白。利用GST pull-down和ELISA板结合试验发现这七个蛋白可从血清中募集FH,并且这七个蛋白结合FH具有剂量依赖性,蛋白浓度越高,结合FH的能力越强。蛋白抑制试验证明每个蛋白均能显著降低ExPEC对FH的募集作用(P<0.05)。以上试验揭示这7个蛋白能够从血清中募集对FH。通过免疫荧光试验、菌落印迹试验和Western blotting试验,确定这七个蛋白均位于ExPEC菌株RS218的外膜。ELISA检测发现细菌表面的FH募集水平和C3b沉积水平分别以FH浓度依赖性方式显著增加和减少(P<0.05)。抗吞噬试验表明FH募集显著增强ExPEC抵抗人巨噬细胞THP-1调理吞噬作用的能力(P<0.05),而且募集的FH越多,ExPEC的抗调理吞噬能力越强。本研究揭示ExPEC利用细菌表面的CMEs结合FH,降低C3b在细菌表面的沉积,进而增强抗调理吞噬能力来逃避补体杀伤作用的新机制。

摘要译文

关键词：

肠外致病性大肠杆菌; 转铁蛋白; 延伸因子G; 延伸因子Tu; 血清耐受; 胞内存活; 补体系统; H因子; 调理吞噬

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

预防兽医学

导师：

戴建君

中图分类号：

S852.61[病原细菌]

学科分类号：

090601[基础兽医学];090608[兽医生物工程学];090609[兽医生物信息学]

D O I：

10.27244/d.cnki.gnjnu.2022.002394