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基于介孔ZIF-8的固定化血管紧张素转化酶的构建及应用研究认领

被引量： 1

作者：

王则奋

学位授予单位：

广西大学

摘要：

血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE）是人体内血压调控系统的关键酶,活性过高,会引起人体血压升高。ACE抑制肽通过抑制ACE的活性来达到降血压的作用。ACE抑制肽通常采用酶解法制备,得到的酶解液成分十分复杂,需要进行分离纯化才能得到具有高抑制活性的组分。传统的分离方法步骤繁琐、耗时长,因此急需开发一种能快速筛选ACE抑制肽的方法。本文采用原位包埋法制备了具有高活性、高稳定性的固定化ACE,并将其作为亲和分离介质,用于蛋白酶解液中ACE抑制肽的快速分离纯化。主要研究内容及结果如下: （1）以2-甲基咪唑（2-Me IM）、Zn（NO3）2和猪肺ACE粗提液为原料,采用原位包埋法制备固定化血管紧张素转化酶ACE@mZIF-8。为解决ACE@mZIF-8使用过程中ACE的泄露问题,利用多巴胺的自聚合反应,在其表面包裹聚多巴胺层,制备得到固定化酶—ACE@mZIF-8/PDA（AmZP）。以酶活回收率为考察指标,通过单因素实验确定AmZP的最佳制备工艺条件:2-Me IM浓度为20 mmol·L-1,Zn（NO3）2浓度为10 mmol·L-1,反应时间为30 min,pH为7.3,温度为30℃,ACE粗提液蛋白浓度为4 mg·m L-1,多巴胺聚合时间为4 h。制备得到的AmZP能有效降低酶的泄露,酶活回收率为36.75%,酶固定化率为89.74%。采用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、红外光谱（FITR）、X-射线衍射（XRD）和N2吸附-解吸等温线实验对AmZP进行表征,结果表明AmZP成功包裹ACE,呈表面粗糙的球形,粒径为100～200 nm,具有无定型结构,孔径为3～4 nm。对AmZP的酶学性能进行研究。结果表明,ACE固定化后,最适催化条件发生偏移,最适pH为8.8,最适温度为47℃。与游离酶相比,AmZP具有良好的pH稳定性、热稳定性、抗化学试剂变性和储存稳定性,重复使用10次后,仍保持82.29%的酶活,说明具有良好的操作稳定性。（2）采用分子对接、紫外光谱、荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱,对ZIF-8前体(2-Me IM、Zn（NO3）2)与ACE之间的相互作用进行研究,探讨ACE@mZIF-8的合成机理。研究结果表明,2-Me IM和Zn2+在ACE上存在多个结合位点,通过氢键、疏水作用、π-阳离子作用和π-堆积作用与ACE结合,诱导介孔ZIF-8在ACE周围结晶,最终形成ACE@mZIF-8。结合过程引起ACE构象的变化。（3）采用“grafting to”策略将DA-PEGx-DA聚合物锚定到ACE@mZIF-8/PDA表面,制备了对ACE抑制肽具有高特异性吸附的复合材料——ACE@mZIF-8/PDA/DA-PEGx-DA（AmZPPx）。以牛血清白蛋白（BSA）为非特异性吸附蛋白模型,研究了AmZPPx的抗非特异性吸附效果。结果表明,当PEG分子量为5000,DA-PEG5000-DA浓度为0.2 mmol·L-1,改性时间为30 min,制备得到的AmZPP5000具有良好的抗非特异性吸附性,对BSA的吸附量为12.19 mg·g-1,仅为AmZP的26.11%。以VPP（ACE竞争性抑制肽）和GF-6（ACE非竞争性抑制肽）为特异性吸附多肽模型,对AmZPPx的特异性吸附性能进行研究。结果表明AmZPP5000对VPP和GF-6具有良好的选择性吸附,最大吸附量分别为43.63 mg·g-1和227.1 mg·g-1,吸附过程属于物理单分子层吸附,颗粒内扩散是主要的控制过程。（4）采用酶解法对短吻鲾鱼肉蛋白进行水解,制备ACE抑制肽,并对酶解工艺进行研究,得到最佳的酶解工艺条件:选用碱性蛋白酶进行酶解,酶解时间为3 h、温度为45℃、pH为9.5、酶/底物为4000U/g,水解度控制在25%左右,得到的酶解液具有最高的ACE抑制活性,IC50值为0.623mg·m L-1。（5）以AmZPP5000为亲和介质对短吻鲾鱼肉蛋白酶解液中的ACE抑制肽进行快速分离,并利用MALDI-TOF/TOF质谱仪对洗脱液的组分进行鉴定,最终解析得到4种新型的ACE抑制肽:Val-Thr-Met-Phe-Thr-Cys（VC-6）,His-Pro-Arg-Ala-Trp-Phe（HF-6）,Arg-Ser-Glu-Val-His-Tyr-Arg-Met（RM-8）,Ala-Asp-Thr-Arg-Arg-Pro-Ala-His-Arg-Glu（AE-10）,IC50值分别为:341.19、44.67、30.06、17.70μmol·L-1,即0.239、0.036、0.032、0.021 mg·m L-1。（6）对VC-6、HF-6、RM-8和AE-10的抑制类型进行研究,发现VC-6和HF-6为混合型抑制,RM-8和AE-10为竞争性抑制剂。采用Autodock Vina研究4种多肽与ACE之间的相互作用位点和相互作用力。结果发现四种多肽均能以不同的作用力与ACE结合,形成稳定的复杂结构,从而达到抑制ACE的目的。其中HF-6和RM-8能与ACE活性位点的关键氨基酸残基结合。利用在线工具Toxin Pred和ADMETlab预测VC-6、HF-6、RM-8和AE-10的ADMET性质。结果表明这四种多肽的ADMET参数都在可接受的范围之内,可作为活性物质参与功能食品的开发。

摘要译文

关键词：

介孔ZIF-8; 固定化血管紧张素转化酶; ACE抑制肽; 亲和分离

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

化学工艺

导师：

廖丹葵

中图分类号：

Q814.2[固定化酶和固定化细胞技术]

学科分类号：

0710[生物学];083602[酶（蛋白质）工程];083604[生物过程工程]

D O I：

10.27034/d.cnki.ggxiu.2023.002914