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Polycystin1对破骨细胞生成和失用性骨质疏松症的作用机制研究认领

作者：

黄梅

学位授予单位：

中南大学

摘要：

研究目的:探究在失用性骨质疏松症（Disuse osteoporosis,DOP）中破骨谱系细胞是否通过Polycystin1（PC1）感受机械负荷进而影响骨重塑,进一步阐明PC1调控破骨细胞生成的具体分子机制,并评估靶向PC1-TAZ轴的小分子化合物Zinc01442821对破骨细胞生成以及DOP的影响。研究方法: 1.通过悬尾构建DOP的动物模型,利用micro-CT、免疫组化染色以及TRAP染色评估骨代谢情况; 2.DOP小鼠骨髓单核巨噬细胞（Bone marrow monocytes/macrophages,BMMs）以及经微重力干预后的BMMs进行破骨分化诱导,利用q PCR、TRAP染色、WB以及RNA-seq评估破骨细胞生成以及破骨谱系细胞中PC1的表达水平; 3.在Pkd1 flox/flox（Pkd1为PC1的编码基因）小鼠骨髓腔内注射AAV2/2-F4/80-cre-Zs Green,实现在巨噬细胞上特异性敲除Pkd1(Pkd1BMM△);将Pkd1 flox/flox小鼠与破骨前体细胞特异性Cre转基因小鼠杂交,获得破骨前体细胞特异性Pkd1基因敲除小鼠(Pkd1TRAP△),将这两种条件性敲除小鼠及其对照小鼠进行悬尾,利用micro-CT、免疫组化染色、TRAP染色、免疫荧光以及q PCR等方法评估Pkd1的敲除效率以及骨代谢情况; 4.提取Pkd1TRAP△小鼠BMMs进行破骨分化诱导、使用γ分泌酶抑制剂DAPT以及PC1碳末端尾（C-terminal cytoplasmic tail,CTT）结构域的过表达质粒干预破骨细胞,运用TRAP染色、骨吸收活性检测、F-actin免疫荧光染色、RNA-seq以及q PCR评估PC1-CTT对破骨细胞生成的影响; 5.免疫共沉淀检测PC1与TAZ的结合;siRNA沉默以及质粒过表达TAZ,利用TRAP染色、骨吸收活性检测、q PCR、RNA-seq、Ch IP-seq以及Ch IP-q PCR探究TAZ对破骨细胞生成的影响并明确相关的分子机制;siRNA沉默PC1以及DAPT抑制γ分泌酶的活性,利用q PCR以及WB检测PC1-CTT对TAZ核易位的影响。 6.在Taz flox/flox小鼠骨髓腔内注射AAV2/2-F4/80-cre-Zs Green,实现在巨噬细胞上特异性敲除Taz(Taz BMM△),进一步利用micro-CT、免疫组化染色、TRAP染色、免疫荧光以及q PCR等方法评估Taz的敲除效率以及骨代谢情况; 7.使用小分子化合物Zinc01442821干预破骨细胞,利用TRAP染色、WB以及q PCR评估Zinc01442821对破骨细胞生成以及TAZ核易位的影响;DOP小鼠腹腔注射Zinc01442821或对照溶剂,利用micro-CT、免疫组化染色以及TRAP染色评估骨代谢情况。研究结果: 1.与对照小鼠相比,DOP小鼠破骨细胞数目增加,成骨细胞数目减少,骨量显著降低。 2.与对照BMMs相比,DOP小鼠BMMs以及经微重力干预后的BMMs分化为破骨细胞的能力增强,同时伴有PC1表达量的显著增加;RNA-seq分析结果表明,微重力可以上调机械敏感相关信号通路以及促进破骨细胞融合。 3.与对照小鼠相比,Pkd1BMM△以及Pkd1TRAP△小鼠破骨细胞数目减少,成骨细胞数目无明显差异,骨量增加;此外,Pkd1BMM△以及Pkd1TRAP△小鼠均可以对抗悬尾诱导的破骨细胞数目增加以及骨量减少。 4.与对照小鼠BMMs相比,Pkd1TRAP△小鼠BMMs分化为破骨细胞的能力减弱;RNA-seq分析结果表明,沉默Pkd1可以下调破骨细胞分化相关通路和基因;γ分泌酶抑制剂DAPT可以抑制破骨细胞生成,而质粒过表达CTT则可以促进破骨细胞生成。 5.PC1与TAZ可以在蛋白水平相结合;siRNA沉默TAZ抑制破骨细胞生成,进一步RNA-seq分析结果表明,沉默TAZ可以下调破骨细胞分化相关通路和基因,而质粒过表达TAZ则可以促进破骨细胞生成;抑制PC1/CTT可以显著减少TAZ的核易位;Ch IP-seq以及Ch IP-q PCR明确TAZ可以结合到破骨细胞相关基因的启动子上。 6.与对照小鼠相比,Taz BMM△小鼠破骨细胞数目减少,成骨细胞数目无明显差异,骨量增加。 7.Zinc01442821可以抑制破骨细胞生成以及TAZ的核易位;与对照组相比,Zinc01442821干预的DOP小鼠破骨细胞数目和脂肪空泡减少,成骨细胞数目增加,骨量增加。研究结论: 1.破骨谱系细胞通过PC1感受机械负荷进而促进DOP的发生; 2.PC1通过增加TAZ入核从而促进破骨细胞生成; 3.Zinc01442821通过抑制破骨细胞和脂肪空泡生成、促进成骨细胞生成从而延缓DOP的骨丢失。图25幅,表13个,参考文献91篇

摘要译文

关键词：

失用性骨质疏松症; 破骨细胞; 机械负荷; Polycystin1; TAZ

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

内科学

导师：

李长俊

中图分类号：

R580;R58[内分泌腺疾病及代谢病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27661/d.cnki.gzhnu.2023.006123