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人参皂苷Rb1干预Ang Ⅱ诱导心肌肥大的效应与机制研究认领

作者：

王师花

学位授予单位：

上海中医药大学

摘要：

目的:心肌肥大是心力衰竭的核心病理环节,是心血管患者不良临床结局的独立危险因素之一。因此,控制心肌肥大对延缓或逆转心力衰竭进展具有重要的临床意义。炎症机制在心肌肥大和心力衰竭病理形成中扮演重要的角色,已成为防治心肌肥大和心力衰竭的干预靶点。本研究对人参的主要成分人参皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1,Rb1）抗心肌细胞肥大及抗炎双重活性防治心肌肥大的药理学意义进行探讨,以期进一步理解Rb1的心血管药理作用,为人参的相关临床应用提供新的实验依据。方法:1.采用微量渗透泵持续输注血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的心肌肥大小鼠模型,观察Rb1对心肌肥大及相关炎症的影响。（1）通过经胸超声心动图分析,评估Rb1干预对Ang II小鼠心脏结构和功能的影响;（2）计算小鼠心脏质量指数:测算心脏重量/体重（Heart weight/Body weight,HW/BW）和心脏重量/胫骨长度（Heart weight/Tibia length,HW/TL）,分析Rb1干预对Ang II小鼠心脏质量指数的影响;（3）通过麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）免疫组织化学分析,标记心脏组织中心肌细胞轮廓,分析Rb1干预对Ang II小鼠心肌细胞横截面积的影响;（4）采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time q PCR）,分析心脏组织A型钠尿肽（Natriuretic peptide type A,Nppa）、B型钠尿肽（Natriuretic peptide type A,Nppb）和肌球蛋白重链（Myosin,heavy polypeptide7,cardiac muscle,beta,Myh7）基因m RNA表达水平,在分子水平进一步验证Rb1抗心肌细胞肥大的效应;（5）采用天狼星红染色观察心脏组织的纤维化情况,评价Rb1干预对AngⅡ小鼠心肌纤维化的影响;（6）采用透射电子显微镜观察心肌超微结构,分析Rb1干预对AngⅡ小鼠心肌超微结构的影响;（7）采用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析小鼠血浆中炎症因子白细胞介素1β（Interleukin-1 beta,IL-1β）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）的水平,评价Rb1干预对Ang II小鼠系统性炎症的影响;（8）通过苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色对心脏组织病理改变进行分析,评价Rb1干预对Ang II小鼠心肌炎症损伤等病理改变的影响;（9）采用免疫组织化学方法,对髓系免疫细胞和巨噬细胞分子标志物CD11b和CD68在心肌组织的免疫阳性情况进行分析,评价Rb1对Ang II小鼠心脏组织免疫细胞浸润的影响;（10）采用real-time q PCR,对心脏组织炎症因子Il1b、Il6和Tnf基因的m RNA表达水平进行分析,评价Rb1对Ang II小鼠心肌组织炎症的影响。2.采用AngⅡ和苯肾上腺素（Phenylephrine,PE）刺激的H9c2心肌细胞肥大模型,研究Rb1抗心肌肥大的直接细胞学效应与可能的机制。（1）通过罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine phalloidin）染色标记心肌细胞骨架,观察Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞肥大的干预效应;（2）通过细胞免疫荧光染色,观察Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞中ANP水平的影响;（3）采用JC-1荧光探针进行细胞染色,分析Rb1对AngⅡ和PE诱导的心肌细胞线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）改变的影响;（4）采用膜通透性荧光探针钙黄绿素乙酰甲酯（Calcein AM）进行细胞染色,分析Rb1对AngⅡ诱导的心肌细胞线粒体膜通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）开放程度的影响。（5）采用western blotting,分析Rb1对AngⅡ刺激的H9c2心肌细胞中信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）表达及磷酸化的影响。3.采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型和AngⅡ诱导的骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）炎症模型,研究Rb1的直接抗炎效应与机制。（1）采用ELISA分析RAW264.7巨噬细胞培养上清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF的含量,直接评价Rb1的抗巨噬细胞炎症的效应;（2）采用real-time q PCR分析Rb1对RAW264.7巨噬细胞以及BMDM中炎症因子Il1b、Il6和Tnf编码基因m RNA表达水平的影响;（3）采用Western blotting分析Rb1对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白细胞外信号调节激酶（Extracellular-signal-regulated kinase 1/2,Erk1/2）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p38以及上游蛋白丝裂原活化蛋白激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2,MEK1/2）磷酸化的影响;（4）采用real-time q PCR分析Rb1对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞以及AngⅡ刺激的BMDM中mi R-155表达的影响;（5）采用western blotting分析Rb1对LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞STAT3磷酸化的影响;（6）采用real-time q PCR分析Rb1对转染agomir-155或agomir-NC的RAW264.7巨噬细胞炎症因子Il1b、Il6和Tnf编码基因m RNA表达的影响。结果:1.（1）心脏超声结果表明:与假手术（Sham）组相比较,AngⅡ组小鼠心脏室间隔厚度（Interventricular septal thickness,IVS）增加（P<0.05）,左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短缩分数（Fractional shortening,FS）均代偿性增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1高剂量（Rb1-H,100 mg/kg）组小鼠心脏IVS降低（P<0.05）,Rb1低剂量（Rb1-L,6.25 mg/kg）、Rb1中剂量（Rb1-M,25 mg/kg）小鼠LVEF和FS与Sham组基本一致,未见代偿性增加。各组左室舒张末期后壁厚度（Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd）、左室舒张末期内径（Left ventricular end-diastolic internal diameter,LVIDd）和左室舒张末期容积（Left ventricular end-diastolic volume,LVEDV）均未见明显变化（P>0.05）。（2）心脏质量指数分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组HW/BW和HW/TL显著增加（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组HW/BW和HW/TL均不同程度降低（P<0.05）。（3）WGA染色结果表明:Sham组小鼠心肌细胞轮廓清晰;与Sham组相比较,AngⅡ组小鼠心肌细胞轮廓增大,部分心肌细胞边界染色加深,或边界不清,心肌细胞横截面积显著增加（P<0.05）;Rb1-L、M、H组小鼠心肌细胞轮廓未见显著异常,细胞边界较为清晰,心肌细胞横截面积较AngⅡ组有不同程度的减小（P<0.05）。（4）心脏组织real-time q PCR分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组小鼠心脏组织Myh7基因m RNA表达显著升高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组小鼠心脏组织Myh7基因m RNA表达显著降低（P<0.05）,Nppa和Nppb基因m RNA表达水平各组未见显著差异（P>0.05）。（5）天狼星红染色结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组可见心脏大血管周围以及心肌组织间明显的纤维化改变;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组心脏大血管周围纤维化呈不同程度减轻（P<0.05）,其中Rb1-H组心脏大血管周围纤维化减轻最为显著。Rb1-M、H组心肌组织间纤维化改变也显著减轻（P<0.05）,Rb1-L组心肌组织间纤维化较AngⅡ组未见显著改变（P>0.05）。（6）电镜结果表明:Sham组心肌纤维排列有序,Z线清晰可见,线粒体形态大小正常,线粒体嵴致密;与Sham组相比较,AngⅡ组可见形态受损的线粒体（P<0.05）,线粒体嵴的形状破坏和密度降低;相比之下,Rb1各组结构受损的线粒体数量显著减少（P<0.05）。同时,AngⅡ组的Z线明显紊乱且数量减少（P<0.05）;与Ang II组相比较,Rb1各组Z线形态均较为完整,Rb1-M、H组Z线数量显著增加（P<0.05）。（7）ELISA分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组血浆IL-6水平增高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组血浆中IL-6的水平均降低（P<0.05）;各组IL-1β和TNF血浆水平未见显著差异（P>0.05）。（8）H&E染色结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏大血管周围以及心肌组织间可见大量炎性细胞浸润;与AngⅡ组相比,Rb1-L、M、H组心脏大血管周围以及心肌组织间炎性细胞浸润呈不同程度减轻,其中Rb1-H组心脏大血管周围及心肌组织间炎性细胞浸润减轻程度的最为显著。（9）免疫组织化学分析结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏组织中浸润的CD68+巨噬细胞显著增多（P<0.05）;而与AngⅡ组相比较,Rb1-L、M、H组心脏组织中浸润的CD68+巨噬细胞均减少（P<0.05）。（10）Real-time q PCR结果表明:与Sham组相比较,AngⅡ组心脏组织Il6基因m RNA表达显著升高（P<0.05）;而与AngⅡ组相比较,Rb1组心脏组织Il6基因m RNA表达降低（P<0.05）;Il1b和Tnf在三组小鼠心脏组织的表达未见显著差异（P>0.05）。2.（1）Rhodamine phalloidin染色表明:AngⅡ诱导心肌细胞面积增大（P<0.05）,3.125μM Rb1干预后心肌细胞面积与AngⅡ组相比较无统计学差异（P>0.05）,12.5μM、50μM和100μM Rb1干预后心肌细胞面积显著减小（P<0.05）。此外,PE可诱导心肌细胞面积显著增大（P<0.05）,与PE组相比较,100μM Rb1干预的心肌细胞面积减小最为显著（P<0.05）。（2）免疫细胞荧光染色结果表明:与溶剂对照（VC）组相比较,AngⅡ组心肌细胞中ANP的水平显著升高（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组心肌细胞中ANP水平显著降低（P<0.05）。在PE诱导的心肌细胞肥大模型中,Rb1干预后也观察到相似的结果。（3）JC-1染色结果表明:AngⅡ可导致心肌细胞MMP降低,表现为红色JC-1聚合物荧光强度与绿色JC-1单体荧光强度比值降低（P<0.05）;与AngⅡ组相比较,Rb1组红色JC-1聚合物荧光强度与绿色JC-1单体荧光强度比值增加（P<0.05）,提示Rb1干预增加心肌细胞MMP。在PE诱导心肌细胞肥大模型中,Rb1干预后观察到相似的结果。（4）m PTP开放程度分析结果表明:AngⅡ诱导m PTP开放,

摘要译文

关键词：

人参皂苷Rb1; 心肌肥大; 心肌细胞; 炎症反应; 巨噬细胞; IL-6; miR-155

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

中西医结合临床

导师：

陈瑜

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27320/d.cnki.gszyu.2021.000084