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喹诺酮类抗生素跨血-脑屏障及致痫机制的研究认领

作者：

岑雨樱

学位授予单位：

中国人民解放军医学院

摘要：

背景:喹诺酮类抗生素(Quinolones antibiotics,QNs)是临床治疗中一类具有抗菌谱广、活性强、稳定性好、半衰期长、生物利用度高、口服吸收效果好、组织浓度高等多种优点的全合成抗菌药物。除了在呼吸系统、泌尿系统、消化系统、皮肤和软组织等各种外周感染中被广泛运用以外,对中枢神经系统(central nervous system,CNS)感染的治疗也有很大的临床价值。大部分喹诺酮类抗生素对需氧革兰氏阴性菌最有效,包括肠杆菌科、嗜血杆菌、奈瑟菌和卡他莫拉菌。当患者对一线抗结核药物出现了耐药性或不耐受时,QNs是最有价值的二线抗结核药物。既往研究已经证明QNs在外周系统(肾脏、肠道、肺部等)中是多种膜转运蛋白(Transporter,也叫转运体)的底物,包括P-糖蛋白(Pglycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(Breast Cancer Resistance Protein,BCRP)、多药耐药相关蛋白(Multidrug Resistance-Associated Proteins,MRPs)、和有机阴离子转运体(Organic Anion Transporters,OATs)。这些转运蛋白在血-脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)和血-脑脊液屏障(Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier,BCSFB)上也有表达。目前,这些转运蛋白对QNs在CNS分布的影响尚不清楚。QNs在脑脊液(Cerebrospinal Fluid,CSF)和脑细胞外液(Extracellular Fluid,ECF)中的分布可能不同。此外,在使用QNs治疗CNS感染时,药物的神经毒性是一个不可回避的问题。喹诺酮类抗生素致痫机制目前尚不明确,关于机制假说的验证多是体外实验研究或临床资料的总结,在动物体内验证以上机制的研究较少。研究目的1、联合使用高效液相色谱(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)和微透析技术同时测量大鼠血液、海马ECF和侧脑室CSF中QNs的游离浓度,以全面了解QNs在脑内的药代动力学情况。存在和不存在各种转运蛋白抑制剂的情况下,比较QNs在脑内的分布情况。明确各个转运蛋白在QNs脑内转运机制中所起的作用,为今后通过调节转运蛋白功能控制药物的脑分布奠定理论基础,为临床用药中可能出现的药物间相互作用提供理论依据。2、联合使用遥测信号采集系统及微透析技术测量大鼠脑内药物浓度、神经递质水平及脑电效应情况,同步视频监测大鼠行为学改变。在QNs致痫的大鼠模型上探究三者间的相关关系,探究QNs可能的致痫机制。研究方法:1、制备大鼠海马、侧脑室双位点的微透析模型,之后在颈内静脉植入血管探针。将75只大鼠随机分为3大组,每组25只大鼠,按QNs类别分为环丙沙星(Ciprofloxacin,CFX)组、左氧氟沙星(Levofloxacin,LVFX)组和莫西沙星(Moxifloxacin,MFX)组。每大组再根据转运蛋白抑制剂的不同分为5个亚组,每个亚组5只大鼠,详细分组如下:(1)对照组(n=5)QNs+空白溶质载体;(2)TAR组(n=5):QNs+Tariquidar(8mg/kg);(3)Ko143组(n=5):QNs+Ko143(15mg/kg);(4)MK571组(n=5):QNs+MK571(20mg/kg);(5)PRO组(n=5):QNs+丙磺舒(50mg/kg)。每组的干预药物经腹腔注射给药,30min后经尾静脉注射相应的QNs。从静脉注射QNs起进行微透析液采集,每15分钟收集1次。每个时间点同步得到的脑ECF、CSF及血液的透析液使用高效液相色谱仪进行测量分析得到相应的药物浓度。将药物-时间曲线代入Phoenix Win Nonlin version 8.2.0软件进行分析,计算QNs在大鼠脑内和血液中的各项药代动力学参数。2、将40只大鼠随机分为2组,每组20只,分别为脑微透析组和脑电模型组#。每大组根据不同的给药方案再平分为4小组,每组5只。详细分组如下所示:组1/组1#(n=5):0.5%CMC灌胃+0.1mol/L盐酸溶液腹腔注射;组2/组2#(n=5):0.5%CMC灌胃+CFX(50mg/kg i.p.);组3/组3#(n=5):0.5%CMC灌胃+CFX(200mg/kg i.p.);组4/组4#(n=5):100mg/kg联苯乙酸(Biphenyl Acetic Acide,BPAA)灌胃+CFX(50mg/kg i.p.)。两大组的实验流程一致,平衡2h后进行灌胃,灌胃1h后腹腔注射相应的剂量的CFX,注射药物后采集3.5h,总实验时长6.5h,连续进行不中断。将海马处采集的微透析液分为两份,分别使用紫外检测器测量透析液中CFX浓度,使用荧光检测器测量透析液中的谷氨酸(Glutamic acid,Glu)和γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid,GABA)的水平。脑内药物浓度使用Phoenix Win Nonlin version 8.2.0软件进行计算各项药代动力学参数,脑电信号采集后使用Neuroscore软件进行相对功率谱分析。研究结果:1、CFX在脑ECF和CSF中的非结合分配系数(Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF)分别为30.76±4.1%和35.14±4.6%。当丙磺舒与CFX合用时,大鼠血液和脑ECF中的药时曲线下面积(Area under curve,AUC)、半衰期(half-life period,T1/2)和平均驻留时间(Mean retention time,MRT)显著增加(p<0.05)。Ko143的干预也能提高CFX的脑内浓度。在BBB上,对CFX影响最大的转运蛋白是P-gp。Tariquidar(P-gp抑制剂)的预处理使得Kp.uu.ECF提高了1.45倍(p<0.05)。在BCSFB上,对CFX影响最大的转运蛋白是MRPs。MK571(MRPs抑制剂)的预处理使得Kp.uu.CSF提高了1.53倍(p<0.05)。2、LVFX在脑ECF和CSF中的Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别为33.90±1.7%和41.18±2.4%。当丙磺舒与LVFX合用时,大鼠血液和脑内的AUC、T1/2和MRT显著增加(p<0.05)。Ko143的干预增加了脑ECF中LVFX的水平。MRPs在介导LVFX从脑外排到血液起重要作用。MK571(MRPs抑制剂)干预后,Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别增加1.36倍和1.16倍(p<0.05)。3、MFX在脑ECF和CSF中的Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别为22.42±1.5%和28.13±0.7%。当丙磺舒与MFX合用时,大鼠脑内的AUC值显著增加(p<0.05)。Tariquidar的干预也能提高MFX脑ECF的分布。BCRP是介导MFX脑内转运的主要转运蛋白。Ko143(BCRP抑制剂)的干预后,Kp.uu.ECF和Kp.uu.CSF分别增加1.56倍和1.63倍(p<0.05)。4、药代动力学(Pharmacokinetics,PK)参数提示3种QNs在CSF和脑ECF中分布情况类似。脑脊液QNs浓度可以作为评估脑细胞外液中QNs浓度的替代物。5、所有经BPAA预先处置的大鼠均在QNs给药后出现明显的痫性发作,其余分组未观察到明显的行为学改变。6、本研究中海马处Glu的基线水平为0.976±0.270μg/ml,GABA的基线水平为0.049±0.006μg/ml。组3(0.5%CMC灌胃+CFX 200mg/kg i.p.)大鼠在给药后45-75min的区间内Glu相对于基线水平上升(p<0.05)。组4(100mg/kg BPAA灌胃+CFX 50mg/kg i.p.)大鼠观察到Glu和GABA相对于基线水平均有上升。Glu的上升趋势比GABA明显,峰值早于GABA出现约45min。GABA上升较为缓慢,峰值稍延后。7、组4#中可以观察到δ波和θ波段相对功率的轻度下降,α波和β波段相对功率的上升。其中α波段相对功率上升最明显(p<0.05),CFX给药后30min起持续至2.5h。α波段的相对功率与行为学评分成正相关。8、Glu的变化情况与α波段相对功率变化情况基本同步,GABA的变化稍迟滞。组4中的大鼠脑内CFX消除过程较未致痫组大鼠明显减慢。结论:1、QNs从CNS外排涉及P-gp、MRPs、BCRP和OATs。P-gp是BBB上主要外排CFX的转运蛋白,MRPs是BCSFB上主要外排CFX的转运蛋白。MRPs是限制LVFX在CNS分布的主要转运蛋白,BCRP是限制MFX在CNS分布的主要转运蛋白。2、脑脊液QNs浓度可以作为评估脑细胞外液中QNs浓度的替代物。3、神经递质的水平异常是QNs导致癫痫发生的原因。NMDA受体的激活直接参与QNs的致痫机制。4、α波段的相对功率对QNs诱发的癫痫发作最敏感,行为学改变与EEG功率变化趋势一致。

摘要译文

关键词：

药物转运蛋白; 血-脑屏障; 血-脑脊液屏障; 喹诺酮类抗生素; 氨基酸神经递质; 脑电图

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

张家堂

中图分类号：

R978.1[抗生素];R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100707[临床药学];100210[神经病学]

D O I：

10.27637/d.cnki.gjyjc.2023.000069