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栾树（Koelreuteria paniculata）MIPS基因克隆及其调控Cd抗性机理研究认领

作者：

周韬

学位授予单位：

中南林业科技大学

摘要：

植物修复技术是土壤重金属污染治理与修复的重要途径,木本抗性植物具有生物量大、生态适应性强、无后续处理问题等优势,在构建土壤重金属污染生态修复系统中,具有显著优势及应用前景。然而,目前木本植物重金属抗性机制研究多停留于生理生化层面,对关键抗性基因的挖掘远不及草本植物,其分子机制研究进展较为迟缓,是其在环境生态修复应用中的重要阻碍因素之一。本研究以南方土壤重金属污染治理与修复的先锋树种栾树(Koelreuteria paniculata)为研究对象,系统开展了栾树抗镉(Cd)特性研究,基于Cd胁迫下的根系转录组分析,筛选克隆了在抗Cd响应中发挥了重要抗性功能的肌醇-1-磷酸合酶基因(Myo-Inositol-1-Phosphate Synthases,MIPS)KpMIPS,进一步阐明了该基因对植物的生物学功能,及其对植物的Cd抗性的相关调控机理。主要研究结果如下: (1)通过单因素Cd胁迫实验,系统比较研究栾树在目前南方地区,广泛使用的两种木本修复植物中的抗Cd特性。研究表明:在不同Cd胁迫浓度水培实验中,胁迫20 d的栾树耐受性指数(TI)均高于毛果杨(Populus trichocarpa)与垂柳(Salix babylonica)约10%～20%,高浓度Cd胁迫下,其根系细胞壁富集Cd含量高于毛果杨与垂柳约5%～10%。相较于毛果杨与垂柳,栾树的根系部氧化应激酶与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路响应Cd胁迫更为敏感,是主要响应Cd胁迫组织器官,其所含的有机酸与果胶类物质,在不同Cd胁迫浓度下的平均含量,均显著大于毛果杨与垂柳约10%以上,且与Cd胁迫浓度成正相关,因此,栾树的抗Cd特性主要体现在根系部,其抗性与富集能力可能与根系有机酸与果胶类物质的代谢调控机制密切相关。 (2)采用转录组学分析栾树Cd胁迫下的转录调控网络,研究表明:Cd胁迫下栾树MAPK信号通路是根系主要应激信号通路,而茎叶中是由植物激素信号通路承担,预示着栾树在Cd胁迫下的转录组存在不同的调控网络,分别对地上部与地下部调控不同的生物学功能响应,以调整植物整体应对Cd胁迫的生理响应。同时,根系部具有显著响应Cd胁迫表达的MIPS基因,该基因在肌醇磷酸盐代谢通路、磷脂酰肌醇信号系统以及次生代谢产物的生物合成通路,都参与了多个重要中间产物的合成调控,依据基因的共表达模式以及代谢产物间相互作用,重构该基因在Cd胁迫下的调控通路网络,表明MIPS的表达可提高栾树细胞壁关键物质的合成与代谢,尤其对细胞壁糖组分形成具有正调控作用。 (3)筛选克隆在Cd胁迫下显著表达的栾树MIPS基因,并通过基因工程技术手段与生物信息学分析,研究该基因可能具有的生物学功能。结果表明:筛选克隆获得的KpMIPS基因总长度为1381 kp,可表达60 KDa分子量具有肌醇-1-磷酸酶活性的蛋白,意味着该基因对肌醇的合成具有促合成生物学功能,且KpMIPS功能定位于细胞核与细胞质中。将KpMIPS转化入拟南芥中,发现该基因对拟南芥(Arabidopsis thaliana)根系具有促生作用,在Cd胁迫下,该基因发挥抗Cd功能的植物器官主要是根系部,抗性功能主要体现在阻遏Cd向地上部分累积的生物学功能,从而保护了KpMIPS过表达拟南芥地上部分免受Cd引起的活性氧损伤影响。 (4)利用农杆菌介导技术开展栾树遗传转化体系构建研究。研究表明:栾树愈伤组织诱导继代外源激素配比为1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.5 mg·L-1 TDZ,愈伤分化配比为 2.0 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA+0.05 mg·L-1 TDZ,分化率在16.67%-36.67%之间。IBA浓度在1.5mg·L-1生根率为70%左右,头孢霉素最佳使用浓度为300 mg·L-1,潮霉素20-30 mg·L-1阳性转化植株筛选效率最高。该遗传转化体系的建立将为栾树遗传改良研究提供技术平台。 (5)通过已构建的遗传转化体系在栾树中过表达KpMIPS,设计单因素Cd胁迫实验研究其对栾树幼苗的Cd抗性调控机理。结果表明:相比空质粒转化对照组,KpMIPS显著提升了栾树幼苗的肌醇含量约3倍,显著提升了栾树幼苗在Cd胁迫下的耐性指数约30%,肌醇含量的提升也使得过表达栾树幼苗果胶与植酸含量分别提高了约34.3%和82.2%,增加了果胶与植酸对Cd2+的螯合量,进而增加了根系Cd富集量的同时,有效保护了根系细胞免受Cd的毒性损伤,降低了 Cd向地上部的迁移率,因此,KpMIPS对栾树幼Cd抗性具有正调控作用。综上所述,本研究结果表明栾树根系代谢物可能是影响其Cd抗性的重要因素之一,KpMIPS基因可通过对根系果胶与植酸的正调控作用,提高栾树幼苗根系对Cd的抗性与富集能力,该基因在Cd胁迫下的完整上下游调控元件揭示还有待进一步的深入研究。总之,本研究为深入开展木本植物重金属抗性基因功能研究提供借鉴,为栾树的遗传改良提高植物生态修复应用价值提供技术参考。

摘要译文

关键词：

Cd胁迫; 栾树; 转录组; 遗传转化; 肌醇; 果胶; MIPS

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

生态学

导师：

王平

中图分类号：

X173[环境植物学];S792.99[其他⑨]

学科分类号：

0713[生态学];083001[环境科学];083610[环境生物工程];0907[林学]

D O I：

10.27662/d.cnki.gznlc.2024.000923