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大肠杆菌ME5012抵御黄色黏球菌捕食表型的关键基因与分子机制认领

作者：

张宁

学位授予单位：

山东大学

摘要：

作为拮抗作用的典型代表，捕食行为是生态系统中广泛存在的细菌相互作用模式，在特定种群的选择和存活过程中发挥了关键作用，成为维持环境细菌多样性的一个重要因素，相关研究为揭示自然界中细菌种群构成以及生物进化过程中的一些关键科学问题提供了重要的线索和实验证据。目前，多数相关研究多关注于捕食细菌攻击策略和杀死及裂解猎物细胞机制上，对于猎物细胞应对捕食攻击的抵御机制的研究相对有限。作为捕食过程中参与种间相互作用的另一个关键参与者，被捕食细菌的防御特征能够在遭遇捕食压力后发生显著的演化过程。这些防御特征涵盖了广泛的机制，涉及到产生药物抗性或者发挥相关毒力因子功能，这些能够导致或者增强猎物细菌的致病性及抗生素耐药性。　　黄色黏球菌是第一个被发现的“微捕食者”，具备对野生型大肠杆菌优异的捕食能力，二者共同构成了实验室水平上研究细菌捕食行为的模式系统之一。在前期工作中，在大肠杆菌大规模染色体缺失突变体文库中筛选获得了突变株ME5012,该菌株表现出稳定的抵御黄色黏球菌捕食的表型，然而所缺失基因均未有与捕食抗性的关联性相关的报道。我们因此开展了相关工作，力求鉴定导致该抗性表型的关键基因，并初步揭示其可能的分子机制。　　首先，基于大肠杆菌ME5012所缺失大片段基因组的信息，我们构建了 7支单基因敲除株和3支以操纵子为单位的敲除株。通过邻近点接的菌落入侵实验，系统表征了黄色黏球菌捕食大肠杆菌不同敲除株在群体水平上的捕食差异。在分析过程中，除了定量统计了黏球菌在移动趋近阶段过程中的位移变化以反映其入侵大肠杆菌菌落的能力，还测定了裂解消耗阶段过程中猎物大肠杆菌菌落面积的变化和存活细胞的数量。结果表明，△fis和△dusB单基因敲除株均表现出一定程度的黄色黏球菌捕食抵御表型，并且△dusB-fis菌株与ME5012的抵御能力最为接近。因此，我们推测,由于大片段的缺失，大肠杆菌ME5012可能通过降低捕食者识别效率和减弱捕食者杀伤能力等方式获得捕食抵御表型，在这一过程中，dusB和fis基因的敲除发挥了关键作用。　　DusB和Fis作为大肠杆菌中的全局性调控因子，我们无法通过其已知功能准确聚焦抵御捕食的关键表型，因此，通过使用iTRAQ高通量测序蛋白质组技术对大肠杆菌ME5012与野生型大肠杆菌MG1655在蛋白表达水平上的显著差异进行对比分析。显著差异蛋白GO聚类、KEGG途径、PPI网络互作等统计分析结果表明，相较于野生型MG1655,大肠杆菌ME5012鞭毛调控网络中的系列关键蛋白表达显著下调或缺失。此外，PPI网络互作中心性分析、细菌移动性检测和透射电镜观察确证了 fis基因对于大肠杆菌鞭毛产生的正调控作用。以大肠杆菌鞭毛调控因子flhDC敲除株作为阳性对照，我们进一步证明了鞭毛的缺失能够在一定程度上降低黄色黏球菌的捕食效率。此外，在基于YOLOv8+ByteTrack算法构建的多目标追踪目标检测体系中，我们对单细胞水平上多个捕食细胞的运动行为进行自动追踪与统计分析。结果表明，大肠杆菌细胞表面鞭毛组分的存在可以促进黄色黏球菌的识别过程，导致趋近猎物细胞的平均速率增加;黄色黏球菌在大肠杆菌ME5012猎物环境下的运动状态与△fis或△flhDC存在时的单细胞运动行为存在明显差异，这意味着除了鞭毛调控外，大片段的缺失还可能通过其它关键组分的变化导致ME5012的抵御表型。　　黏球菌素（又称抗生素TA）是黄色黏球菌捕食大肠杆菌时分泌的杀伤性次级代谢产物。除了降低捕食者识别效率，大肠杆菌ME5012还可能通过影响TA工作效率来达到降低黏球菌杀伤能力的效果。对捕食共培养过程中黄色黏球菌的TA产生进行高效液相定量分析，结果显示，相较于黄色黏球菌的单独培养物，野生型MG1655的存在能够诱导TA的过量产生0.21μg，这一过程对应着TA关键合成基因的表达上调，而ME5012丧失了这一诱导能力，只能诱导黄色黏球菌产生0.02 μg的TA分泌。与此同时，在最小抑菌浓度测定结果中，与MG1655相比，ME5012和△dusB菌株获得了微弱的TA抗性，而该微弱抗性与TA作用靶点LspA蛋白的过量表达无关。有趣的是，我们发现ME5012的外排泵活性和膜流动性与MG1655存在一定差别，这可能是其具备微弱TA抗性的原因。　　综上所述，我们认为大肠杆菌ME5012在大片段敲除后，尤其缺失dusB和fis基因后，引起了细胞状态多维度的变化，通过降低捕食者识别效率和杀伤能力等方式获得了抵御黄色黏球菌捕食的表型。基因fis的缺失引起ME5012细胞表面鞭毛组装发生明显缺陷，显著降低了黄色黏球菌捕食过程中的识别效率;基因dusB的缺失可能导致ME5012丧失了诱导黄色黏球菌过量产生TA的能力;外排泵活性和膜流动性的增强使得ME5012对TA产生了微抗性。该研究为猎物细菌抵御捕食提出了一个新的综合性策略和机制，也为深入理解自然界中捕食压力下病原微生物致病能力和耐药性的快速进化提供了线索和例证。

摘要译文

关键词：

大肠杆菌; 黄色黏球菌; 捕食行为; 抵御机制

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

微生物学

导师：

胡玮李越中

中图分类号：

Q933[微生物遗传学]

学科分类号：

071003[微生物学];071007[遗传学]