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东北红豆杉中紫杉烷类化合物的高效提纯及网络药理学研究认领

被引量： 3

作者：

张雅静

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

东北红豆杉是国家一级保护植物,其针叶中含有紫杉烷二萜类化合物,具有较强的抗肿瘤活性。然而,东北红豆杉成分复杂,紫杉烷类化合物的结构相似且含量很低,对紫杉烷类化合物的高效提纯具有一定难度。因此,本文以东北红豆杉为原料,采用超声波提取法对东北红豆杉针叶、愈伤组织和悬浮细胞中的紫杉烷类化合物进行提取,并采用反溶剂重结晶法和制备型高效液相色谱法(PrepHPLC)对紫杉烷类化合物进行纯化,旨在建立一种高效提纯东北红豆杉中紫杉烷类化合物的方法,并获得高纯度的产物。紫杉烷类化合物对肺癌有着非常显著的疗效,但其作用机制尚不明确,本文采用网络药理学的方法对紫杉烷类化合物治疗肺癌的作用机制进行了解析。通过系列相关实验结果分析,主要的研究结论如下:1、超声波提取法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的高效提取(1)采用超声波提取法从东北红豆杉中提取紫杉烷类化合物(紫杉醇(PTX)、10-去乙酰基紫杉醇(10-DAT)、巴卡亭III、10-去乙酰基巴卡亭III(10-DAB III)、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇(7-Xyl-10-DAT)、三尖杉宁碱(CEPH)、多烯紫杉醇、7-表紫杉醇),比较不同提取条件对目标化合物提取量的影响。Box-Behnken响应面试验得出最佳提取工艺如下:当液固比为20.88倍,超声功率为140.00 W,超声时间为47.63 min,溶剂中乙醇含量为83.50%时,针叶中紫杉烷类化合物的提取量达到最大值,为342.27μg/g±15.34μg/g。扫描电镜(SEM)结果表明:超声波提取后的针叶局部区域破损严重,出现孔隙。超声波提取后的愈伤组织和悬浮细胞的整体结构被破坏,形成细胞碎片。东北红豆杉成分复杂,建立的高效液相色谱法(HPLC)适用于快速有效地分离检测东北红豆杉中的紫杉烷类化合物。系统比较了东北红豆杉针叶、愈伤组织和悬浮细胞中紫杉烷类化合物的产量,通过悬浮细胞的培养提高了紫杉烷类化合物的产量。2、反溶剂重结晶法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的粗提纯(1)建立了反溶剂重结晶法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的粗提纯工艺。试验筛选出最佳的萃取剂为乙酸乙酯,最佳的重结晶溶剂为甲醇,最佳的重结晶反溶剂为水。Box-Behnken响应面试验得出了反溶剂重结晶法纯化东北红豆杉中紫杉烷类化合物的最佳工艺条件如下:当粗提物浓度为555.28 mg/m L,反溶剂与溶剂体积比为28.16倍,沉积温度为22.91℃,沉积时间为1.76 min时,紫杉烷类化合物的纯度达到最大值,针叶中紫杉烷类化合物的纯度为23.238%,悬浮细胞中紫杉烷类化合物的纯度为7.76%。扫描电镜(SEM)结果表明:反溶剂重结晶法可以有效降低东北红豆杉粗品的粒径,控制颗粒形貌。X射线衍射(XRD)实验表明:东北红豆杉粗提物的无定型态在重结晶过程中没有改变,始终保持在无定型态,拉曼光谱实验进一步证实了反溶剂重结晶法没有将东北红豆杉粗提物的结构改变。该重结晶方法可有效提高东北红豆杉中紫杉烷类化合物的纯度,适用于对紫杉烷类化合物的粗提纯。(2)采用电喷雾电离-高分辨质谱(ESI-HRMS)技术对东北红豆杉针叶和悬浮细胞重结晶产物进行化学成分分析,针叶重结晶产物主要检测出85种非紫杉烷类物质,主要为糖类、糖苷类、酯类、酮类、酸类、酚类、醇类物质以及生物碱。悬浮细胞重结晶产物主要检测出18种非紫杉烷类物质,主要为糖类、酯类、酮类、酸类、酚类物质以及生物碱。3、制备型高效液相色谱法对东北红豆杉中紫杉烷类化合物的精提纯建立了一种有效的制备型高效液相色谱法(Prep-HPLC)来纯化东北红豆杉中含量最高的两种紫杉烷类化合物(10-DAT和PTX)。在试验操作中,考察了流速、进样量和柱温对10-DAT和PTX纯度的影响,正交试验结果表明:当流速为10 m L/min,进样量为0.5 m L,柱温为30℃时,10-DAT和PTX的纯度达到最高,分别为95.33%和99.15%。通过SEM、HPLC和ESI-HRMS对纯化的终产物进行表征。结果表明:制备型高效液相色谱法能有效从东北红豆杉中纯化10-DAT和PTX,适用于对10-DAT和PTX的精提纯。4、基于网络药理学和分子对接探讨紫杉烷类化合物治疗肺癌的作用机制通过网络药理学和分子对接研究紫杉烷类化合物治疗肺癌的靶点、通路的作用机制。利用Pub Chem数据库确定紫杉烷类化合物的靶点,构建有效成分-靶点网络。利用Gene Cards数据库确定肺癌的疾病靶点,获取药物靶点与疾病靶点的交集,对交集靶点进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析,筛选出核心靶点,并对紫杉烷类化合物与核心靶点之间的亲和力进行分子对接验证。结果表明:紫杉烷类化合物共有444个靶点,与肺癌疾病靶点映射后共获得131个交集靶点。PPI分析得到的核心靶点为TP53、EGFR、AKT1。GO生物功能富集分析获得1795个生物过程(BP)条目,101个细胞组分(CC)条目,164个分子功能(MF)条目。KEGG通路富集分析获得179条信号通路,筛选出前20条信号通路,主要为癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖通路、癌症中的微小RNA通路等。分子对接结果表明:紫杉烷类化合物与TP53、EGFR、AKT1靶点的分子对接结合能均≤-8.8 kcal/mol,紫杉烷类化合物通过癌症信号通路、癌症中的蛋白聚糖通路、癌症中的微小RNA通路作用于TP53、EGFR、AKT1靶点,在蛋白结合、酶结合、相同蛋白结合等生物功能中发挥治疗肺癌的作用。

摘要译文

关键词：

东北红豆杉; 紫杉烷类化合物; 高效提纯; 分离; 网络药理学

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

农业生物环境与能源工程

导师：

王淑杰

中图分类号：

R284.2[有效成分的分离与提取];R285[中药药理学]

学科分类号：

100801[中药资源学];100804[中药化学];100505[临床中药学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27162/d.cnki.gjlin.2023.007731