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黑木耳三螺旋β-葡聚糖及其纳米复合物的抗肿瘤活性及潜在机制研究认领

作者：

蔡利琴

学位授予单位：

武汉大学

摘要：

癌症作为当前致死率最高的死亡因素之一,一直是科研人员致力攻克的重大难点。目前临床批准常用的抗癌药物,如阿霉素（DOX）、顺铂和紫杉醇等,经多年临床研究发现,它们在高效抗癌的同时也对正常细胞无差别攻击,产生严重的毒副作用。因此,研发毒副作用更小与抗癌活性兼备的新型抗癌药物迫在眉睫。β-葡聚糖作为一类具有抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇、降血糖以及抗氧化等活性的生物大分子,同时具有独特的链构象及自组装特性,被赋予更多功能和应用前景。黑木耳作为我国常见的药食兼用真菌之一,其主要活性成分—黑木耳多糖也颇受关注。研究发现,黑木耳多糖为具有三螺旋构象的β-（1→3）-D-葡聚糖,显示较好的抗小鼠肝癌活性,抑制率高达75%,且基本无毒副作用。然而,其抗肝癌机制尚未阐明;同时,黑木耳三螺旋β-葡聚糖具有很强的自组装能力,可形成具有疏水空腔的纳米管结构,为其负载疏水客体分子提供了重要的结构基础。基于此,本论文从黑木耳中提取三螺旋β-（1→3）-D-葡聚糖,利用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）基代谢组学从分子水平揭示黑木耳三螺旋β-葡聚糖与抗肝癌的潜在机制;同时利用多糖自组装特性、化学改性以及三螺旋构象转变等构建一系列纳米管状复合物,用于靶向递送抗肿瘤药物和纳米粒子,并深入研究黑木耳三螺旋β-葡聚糖纳米管状复合物的抗肿瘤活性及潜在机制。本论文的主要创新点包括以下几点:（1）首次利用UHPLC-MS基代谢组学从分子水平揭示黑木耳三螺旋β-葡聚糖（BFP）的抗人肝癌机制为:BFP通过诱导DNA损伤,减弱DNA损伤修复能力,抑制DNA合成来抑制肝癌细胞增殖;（2）基于BFP在水中自组装成疏水纳米管结构的独特自组装行为,成功将硒纳米粒子（Se NPs）包裹于BFP纳米管中,构建了BFP/Se NPs纳米复合物（BFP-Se）,首次发现BFP-Se可以通过直接与谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢（H2O2）反应产生活性氧自由基增强体内氧化应激,并利用代谢组学揭示BFP-Se促进细胞氧化应激的抗肝癌机制;（3）通过氧化改性BFP,利用席夫碱作用结合顺铂改性前药Pt（IV）,成功构建了负载抗癌前药的BFP纳米管状复合物（BFCP）,并证明BFCP在肿瘤还原微环境下控制释放Pt（Ⅱ）,达到精准杀伤肿瘤的目的;（4）利用BFP在DMSO/水混合溶剂中发生三螺旋链破坏-重构的特点,通过氢键相互作用将BFP分子链以螺旋方式包裹于碳纳米管表面,同时利用亲疏水相互作用负载疏水阿霉素（BSD）用于光热治疗化疗一体化平台治疗易转移的三阴性乳腺癌,基于代谢组学深入探究了BSD的抗乳腺癌机理。本论文主要研究内容如下。首先,利用水热提取法从来自福建厦门的黑木耳子实体中提取黑木耳三螺旋β-葡聚糖BFP,证实它的重复单元为主链中每三个β-（1→3）-连接的葡萄糖残基连接两个β-（1→6）-连接的葡萄糖残基侧链组成。体外细胞实验发现,BFP通过诱导人肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞迁移和侵袭、阻滞肝癌细胞周期于S期来抑制DNA复制,最终导致肝癌细胞增殖抑制。细胞转移实验发现,BFP显著抑制人肝癌细胞的转移与侵袭。基于超高效液相色谱-质谱联用的代谢组学研究结果表明,BFP干扰人肝癌细胞多个代谢通路,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和组氨酸代谢,嘧啶代谢,谷胱甘肽代谢通路,诱导细胞氧化应激导致DNA损伤,减弱DNA损伤修复能力,抑制DNA合成,实现抑制细胞增殖。体外实验进一步验证,BFP促进人肝癌细胞氧化应激升高、脂质过氧化,同时抑制ATP产生。体内荷瘤小鼠模型进一步证实了BFP的抗人肝癌活性。本章为多糖的抗癌机制研究提供了新的研究思路,对多糖类抗癌药物的研发和临床应用提供重要科学依据。利用BFP在水中自组装成疏水空心纳米管特点,成功将Se NPs包裹于BFP的疏水空腔,得到水溶性和稳定性很好的纳米管状复合物BFP-Se。BFP-Se直接与癌细胞内的GSH和H2O2反应,通过消耗GSH和产生活性氧自由基,加速细胞内氧化应激。体外细胞实验表明,BFP-Se显著抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭,同时诱导肝癌细胞凋亡、阻滞细胞周期于S期。利用代谢组学进一步揭示BFP-Se干扰肝癌细胞多条与氧化应激相关的代谢通路,包括谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和戊糖磷酸代谢通路,导致细胞体内氧化应激加剧。氧化应激实验进一步证明,BFP-Se呈剂量依赖性引起细胞体内氧化应激升高、促进脂质过氧化,同时阻碍ATP的产生,导致癌细胞的凋亡。本章基于消除癌细胞谷胱甘肽和增强氧化还原失衡提出了一种肝癌治疗新策略。顺铂药物的高毒性和较差的水溶性,导致直接输送进体内造成极大的副作用。本工作将BFP进行氧化改性,并与改性的顺铂前药Pt（IV）通过席夫碱反应,成功将Pt（IV）负载于BFP纳米管腔内,得到水溶性和稳定性很好的BFP/Pt（IV）,简称BFCP。药物模拟释放研究发现,Pt（IV）在还原条件下响应性释放,在癌细胞内轴向释放两个配体后变成Pt（II）复合物,随后与DNA形成链间交联,发挥抗肿瘤功效。BFCP显著增强癌细胞对Pt的摄取,摄取量比顺铂高250倍;同时BFCP在体外表现出优异的抗癌活性,并且在He La和MCF-7细胞系中比顺铂高50倍,而对处于非还原环境下的正常细胞几乎无毒副作用。细胞凋亡和免疫印迹实验证明,BFCP通过破坏DNA双链引起DNA损伤,从而诱导癌细胞凋亡。体内试验进一步表明,BFCP显著抑制癌细胞的生长,抑瘤率达66.8%,且对小鼠的体重没有影响。由此,BFCP可用作还原性靶向抗肿瘤药物,通过诱导癌细胞凋亡精准杀伤癌症,实现抗癌目的。利用BFP在DMSO/水混合溶剂中发生三螺旋刚性链的破坏-重构的特点,通过氢键和疏水相互作用成功将BFP包裹于单壁碳纳米管SWNT表面,同时负载疏水性抗癌药物阿霉素DOX,得到一种新型的BFP/SWNT/DOX纳米复合物（BSD）。基于SWNT的良好光热效应,DOX和BFP的抗癌活性,将BSD用于光热化疗治疗易转移的三阴性乳腺癌。结果表明,BSD在酸性条件下（p H 5.0）可控制DOX的释放,其负载能力和包封率分别为89.3%和43.5%。BSD显著抑制癌细胞增殖和转移、诱导细胞凋亡,但对正常细胞的毒性显著减弱。BSD具有较好的光热效应和光热循环稳定性,体外实验表明,结合光热治疗具有比单纯的BSD化疗更好的治疗效果。BSD主要利用BFP和DOX的作用阻滞乳腺癌细胞周期于S期,导致DNA合成受到抑制;而结合光热治疗后,则主要阻滞细胞周期于G1期,提前阻断癌细胞DNA复制所需营养物质的合成。非靶向代谢组学研究揭示,BSD显著干扰多种代谢途径,包括嘌呤代谢、磷酸戊糖代谢、谷胱甘肽代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢和能量代谢,导致DNA和RNA合成受到抑制,产生氧化应激,细胞膜完整性破坏,ATP减少,最终造成DNA破坏,引起细胞凋亡。本章为乳腺癌治疗提供了一种潜在新药。上述研究结果首次利用代谢组学在分子水平上研究纳米复合材料的抗肿瘤机制,同时利用黑木耳三螺旋β-D-葡聚糖自身在水中自组装特性、化学改性和在DMSO/水中破坏-重构等特点成功构建了一系列抗肿瘤纳米药物。本工作结合了多学科,包括高分子化学与物理、分析化学、纳米医药以及生物医用材料等交叉应用,为抗癌新药的研发及抗肿瘤机制研究提供了新的思路,同时为构建新型纳米递送材料提供新的策略,具有重要的学术价值和应用前景。

摘要译文

关键词：

黑木耳; 三螺旋β-D-葡聚糖; 纳米复合物; 代谢组学; 抗肿瘤机制

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

高分子化学与物理

导师：

张俐娜许小娟

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27379/d.cnki.gwhdu.2022.001806