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星形胶质细胞大麻素Ⅱ型受体对POCD中脂滴积累与神经炎症的调节及机制研究认领

作者：

张列亮

学位授予单位：

南昌大学

摘要：

随着医疗技术的进步与人类老龄化进程的加快,接受手术的老龄患者数量也在不断增加,术后出现的认知功能障碍也逐渐受到关注。术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction,POCD）是术后常见并发症,尤其在老年患者中更为常见,其临床表现为手术后人格、社交能力及认知能力的变化[1,2]。导致POCD的因素,主要包括:患者自身因素、手术因素和麻醉因素等。随着研究的深入,人们对其致病机制有了更深层次的了解,主要有:胶质细胞介导的炎症反应、线粒体功能的损伤以及细胞自噬功能障碍等[3]。而其中胶质细胞所介导的炎症反应备受关注,在与POCD发病机制相似的中枢神经损伤相关的神经退行性疾病中,发现过量脂滴引起的神经炎症会促进疾病的进展[4]。同时,在POCD患者中也发现了其胶质细胞上有脂滴的积累,且伴随有高炎症反应。因此,阐明POCD患者的胶质细胞中脂滴聚集所诱发的神经炎症反应机制,是治疗POCD的重要突破口。星形胶质细胞作为脑内最为丰富的胶质细胞,在维持脑内稳态平衡中起着至关重要的作用。一方面,星形胶质细胞可分泌多种炎症因子,例如白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）等促炎因子,导致神经元细胞的损伤[5];另一方面,星形胶质细胞也可分泌营养因子与抗氧化因子,如白介素-10（Interleukin-10,IL-10）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）等,减少细胞内氧化应激带来的损伤,从而起到神经保护效应。此外,作为脑内有害物质降解的重要场所,星形胶质细胞中脂滴的分解代谢即可降低神经元细胞的损伤,同时也为细胞的代谢提供了能量底物。另有研究表明:星形胶质细胞中的A1型炎性表型与A2型抗炎表型都与POCD有关,提高A2型星形胶质细胞比例,降低A1型星形胶质细胞的数量是缓解POCD患者神经损伤的重要方式[5,6]。因此,了解星形胶质细胞所参与的生理功能,探索其分解代谢脂滴与缓解神经炎症的具体机制,是探寻POCD治疗学的重要方向。大麻素Ⅱ型受体（Cannabinoid type Ⅱ receptor,CB2R）作为G-蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCR）,是治疗多种炎性相关疾病的重要靶点。在神经退行性疾病的相关研究中发现:阿尔兹海默症（Alzheimer's disease,AD）病人的尸检结果提示:CB2R在AD患者脑内上调明显[7,8];另外激活动物模型中的CB2R可缓解小胶质细胞介导的神经毒性作用[9]。在其他的神经退行性疾病如帕金森病（Parkinson's Disease,PD）、亨廷顿病（Huntington's disease,HD）中都发现了CB2R在脑内明显上调[7]。除此之外,在肿瘤的研究中,也发现了癌症的预后生存、组织分级等都与高表达的CB2R相关[10]。因此,CB2R作为极具治疗潜力的作用靶点,是治疗POCD的潜在受体。因此,了解其作用机制,探索其发挥作用的重要通路,是研究CB2R治疗学的重要方向。本课题在前期的研究基础上,第一部分通过腺相关病毒敲减星形胶质细胞上的CB2R,使用免疫荧光染色与脂滴荧光探针BODIPY染色,检测星形胶质细胞上脂滴的积累;另外通过实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantification PCR,Q-PCR）检测海马脑区脂滴代谢与氧化还原相关基因的表达、行为学检测小鼠的认知能力等,发现CB2R在星形胶质细胞上的敲减会加重POCD中脂滴的积累与认知能力的损伤。同时又在小鼠的侧脑室注入CB2R激动剂JWH133或抑制剂AM630,通过BODIPY脂质探针检测、Q-PCR检测脂滴代谢相关基因以及认知行为学的检测等,发现CB2R的激动不仅减少了星形胶质细胞上脂滴的积累与炎症因子IL-1β的表达,同时缓解了小鼠的认知障碍。在此基础上,我们在第二部分的研究中,通过免疫组化染色、尼氏染色、高尔基染色检测发现:CB2R的激活减少了海马神经元的丢失,抑制了星形胶质细胞的激活,缓解了神经元损伤;另外我们培养U87细胞系,脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）建立体外细胞的炎症模型,使用脂滴荧光探针BODIPY与线粒体膜电位荧光探针JC-1与线粒体探针Mitochondrial Tracker检测CB2R对U87细胞脂滴积累与线粒体功能的影响,发现CB2R的激活减少了LPS引起的脂滴积累、缓解了线粒体功能的损伤。第三部分我们研究CB2R激活影响脂滴积累的机制,通过转染转录因子EB（Transcription factor EB,TFEB）的突变质粒以及转染si RNA-PGC-1α等,观察细胞内自噬相关表型的变化以及脂滴沉积与炎症因子的表达;另外通过染色质免疫共沉淀（Chromatin co-immunoprecipitation,Ch IP）与荧光素酶报告基因实验检测到TFEB与PPARG共激活剂1 alpha（PPARG coactivator 1 alpha,PGC-1α）结合的具体位点为PGC-1α启动子的1100bp-1400bp与1509bp-1850bp位点。因此,本课题阐明了CB2R调控POCD小鼠星形胶质细胞脂滴沉积与代谢降解的具体机制,为后续POCD患者的治疗提供了新的理论基础。第一部分CB2R调控的脂滴积累和神经炎症反应与POCD的相关性目的:研究CB2R是否与POCD中星形胶质细胞的脂代谢及神经炎症相关方法:对在体POCD小鼠模型海马脑区注入星形胶质细胞特异性敲减CB2R的腺相关病毒,通过脂滴探针BODIPY染色检测脂滴,Q-PCR检测海马脑区脂滴代谢相关基因的表达与行为学检测等,观察CB2R的敲减对POCD的影响。同时,在小鼠的侧脑室注入CB2R激动剂JWH133与抑制剂AM630,通过与上述相同的BODIPY染色、行为学检测等,观察CB2R的激动或抑制是否影响小鼠海马脑区脂滴的积累与炎症反应等。结果:（1）星形胶质细胞上CB2R的敲低加重了POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞上脂滴的积累;（2）星形胶质细胞上CB2R的敲低抑制了POCD小鼠海马脑区脂滴代谢相关基因、抗氧化相关基因的表达;（3）星形胶质细胞上CB2R的敲低加重了POCD小鼠的认知障碍;（4）激活CB2R减少了POCD小鼠海马脑区脂滴分子的积累;（5）激活CB2R减少了POCD小鼠海马星形胶质细胞上脂滴的积累;（6）激活CB2R抑制了POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞上IL-1β的表达;（7）激活CB2R提高了POCD小鼠海马脑区脂滴代谢与抗氧化相关基因的表达;（8）激活CB2R缓解了POCD小鼠的认知障碍。结论:（1）CB2R与POCD中脂滴的积累及认知能力相关,敲减海马脑区CB2R会加重POCD小鼠脂滴的积累,损伤认知能力;（2）激活CB2R减少星形胶质细胞中脂滴的积累与炎症因子的表达,缓解认知损伤。第二部分CB2R缓解细胞线粒体功能的损伤与POCD神经保护的相关性目的:研究CB2R是否与POCD小鼠的神经保护及线粒体功能相关方法:在体动物模型中,通过侧脑室注射CB2R激动剂JWH133与抑制剂AM630,使用免疫组化、尼氏染色、高尔基染色等方法观察CB2R与POCD小鼠神经元丢失、星形胶质细胞激活之间的相关性。另外离体培养U87细胞,通过脂滴探针BODIPY染色、线粒体膜电位探针JC-1染色以及线粒体探针Mito Tracker来检测CB2R与U87细胞中脂滴积累及线粒体功能的相关性。结果:（1）激活CB2R抑制POCD小鼠海马脑区星形胶质细胞的激活;（2）激活CB2R缓解了POCD小鼠海马脑区神经元数量的减少;（3）激活CB2R缓解了POCD小鼠海马脑区突触的损伤;（4）激活U87细胞上CB2R减少了LPS引起的脂滴积累;（5）激活U87细胞上CB2R抑制了LPS引起的线粒体膜电位降低;（6）激活U87细胞上CB2R缓解了LPS引起的线粒体数量的减少。结论:（1）在体实验中CB2R的激活缓解了POCD小鼠的神经损伤。（2）离体实验中CB2R的激活缓解了U87细胞中脂滴的积累与线粒体功能的损伤。第三部分CB2R-TFEB-PGC-1α参与的自噬调控促进脂滴分子的降解及减少炎症因子的分泌目的:研究CB2R-TFEB-PGC1α通路调控脂滴分解代谢的具体机制方法:首先干扰U87细胞中TFEB的表达,结合Q-PCR与自噬流双荧光病毒的转染来检测CB2R-TFEB对细胞自噬的调控;其次通过转染TFEB突变位点的质粒GV143-S211A,GV143-S142A,并结合胞浆胞核蛋白的提取与免疫荧光观察TFEB是否入核参与下游自噬的调节;最后结合网站数据分析,应用Ch IP与荧光素酶报告基因实验,验证TFEB与脂代谢关键转录因子PGC-1α的具体结合位点,并干扰PGC-1α来观察CB2R的激活对U87细胞脂滴代谢以及炎症的影响。结果:（1）敲减TFEB会抑制CB2R激活后促进U87细胞自噬相关基因m RNA水平的上调;（2）敲减TFEB会抑制CB2R激活后促进U87细胞自噬流通畅的作用;（3）敲减TFEB会取消CB2R激活后促进U87细胞脂滴降解的作用;（4）敲减TFEB会取消CB2R激活后抑制U87细胞炎症因子IL-6、IL-1β的表达作用;（5）CB2R的激活促进了U87细胞中TFEB的入核;（6）CB2R的激活促进了TFEB第211号丝氨酸的去磷酸化;（7）CB2R的激活促进了PGC-1α的表达;（8）过表达TFEB促进了U87细胞中PGC-1α的表达;（9）CB2R激活后促进了TFEB与PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段的结合,增强了PGC-1α的转录。（10）敲减PGC-1α,取消了CB2R激活后促进脂滴降解及抑制炎症反应的作用。结论:（1）激活CB2R可促进TFEB介导的自噬作用,增加脂滴的分解,减少炎症因子的产生。（2）激活CB2R可促进TFEB与PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段的结合,增强脂滴的代谢。综上所述:本文的创新点在于:（1）阐明了CB2R与POCD中脂滴积累及神经炎症的相关性;（2）揭示了激活CB2R可促进TFEB与脂滴代谢相关基因PGC-1α启动子区1100bp-1400bp及1509bp-1850bp片段结合的机制,为后续开发用于早期防治POCD的靶向性药物提供了新的实验依据和理论支持。

摘要译文

关键词：

CB2R; 星形胶质细胞; 脂滴积累; 神经炎症; 自噬; 术后认知功能障碍

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

麻醉（专业学位）

导师：

徐国海

中图分类号：

R614[麻醉学⑨]

学科分类号：

100202[普通外科学];100221[麻醉学]

D O I：

10.27232/d.cnki.gnchu.2022.004435