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Klotho在氯化锂—匹罗卡品诱导颞叶癫痫大鼠认知功能障碍中的作用及机制研究认领

作者：

向涛

学位授予单位：

广西医科大学

摘要：

颞叶癫痫（Temporal lobe epilepsy,TLE）是临床上最常见的癫痫发作类型之一,约有近一半左右的TLE患者存在认知功能障碍,严重影响患者的生活质量及身心健康,但临床上尚却缺乏有效治疗手段。因此,积极开展针对TLE认知功能障碍发病机制的研究并寻求新的治疗靶点具有重要的理论价值和现实意义。我们前期研究发现TLE共病认知功能障碍的发生机制与海马等脑区神经元铁死亡损伤有关。铁死亡（ferroptosis）是近年来发现的一种铁依赖的非凋亡的细胞程序性死亡方式,触发铁死亡程序的关键要素在于:铁(Fe2+)过度蓄积,谷胱甘肽（GSH）消耗或谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）失活,脂质过氧化物蓄积,其中细胞内铁(Fe2+)过载是触发铁死亡的关键的诱发因素。研究表明,膜铁转运蛋白（ferroportin,FPN）是调控细胞内Fe2+水平维持细胞内铁稳态的关键蛋白,核因子红细胞-2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）的激活参与减轻海马神经元损伤进而改善认知功能的过程,同时可以调控FPN的表达。近年来研究发现,klotho具有神经保护作用及抗认知障碍效应,且海马内klotho表达下调可能与TLE共病认知障碍有关,但其具体作用及机制尚不清楚。本研究将首先明确klotho在氯化锂-匹鲁卡品（lithium-chloride pilocarpine,LiCl-Pilo）构建TLE大鼠海马组织中的表达及细胞定位情况;其次,探讨klotho通过减轻LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马神经元铁死亡损伤进而改善认知功能障碍;最后,从激活Nrf2通路可抑制铁死亡、上调FPN调控海马神经元Fe2+水平的角度来揭示klotho改善TLE认知功能障碍的作用机制,从而为TLE认知功能障碍寻求新的治疗靶点。第一部分Klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马中的表达及细胞定位目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,明确klotho在TLE大鼠海马组织中的表达及细胞定位情况,探讨klotho水平与TLE共病认知障碍之间是否存在相关性。方法:将雄性SD大鼠（8-10周,体重约为250-280g/只）随机分为Con组及LiCl-Pilo组。其中LiCl-Pilo组又分为4个亚组:3 d组、2w组、4w组、6w组,每组20只。大鼠通过腹腔注射LiCl-Pilo构建TLE模型,观察并记录建模后大鼠的癫痫发作情况。造模后根据不同的时间点深度麻醉各组部分大鼠后取材,分别利用免疫蛋白印迹技术（Western blot,WB）、双重免疫荧光技术检测TLE大鼠海马组织中klotho表达水平及细胞定位情况;Con组和6w组采用水迷宫实验评估大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况。结果:（1）行为学结果:Con组没有癫痫发作。LiCl-Pilo组4个亚组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟作用,死亡率为13.75%（11/80）。（2）大鼠海马组织klotho表达水平:WB方法检测结果显示,与Con组相比,各时间点的模型组在给与LiCl-Pilo造模后第3天klotho表达水平开始下降,但统计学无显著意义,在2w至6w期间持续下降,并在4w达到最低,均具有统计学差异（p<0.05或p<0.01）。（3）klotho在海马组织不同类型细胞的共表达情况:采双重免疫荧光检测方法结果显示,在Con组及LiCl-Pilo组中,klotho均与神经元特异性标记物Neun共表达,与星形胶质细胞标记物GFAP不共表达。（4）大鼠认知行为学的研究:水迷宫实验结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠每日找到潜伏平台的平均潜伏期长于Con组大鼠,差异具有统计学意义（P<0.05）;LiCl-Pilo组大鼠穿过平台次数及目标象限游泳时间的百分比均明显下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。两组大鼠在可视平台期中找到潜伏平台的时间和速度无明显差异（P>0.05）。（5）大鼠海马神经元损伤情况的研究:HE染色结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠CA1区细胞计数明显减少,细胞染色变浅、模糊不清,差异具有统计学意义（P<0.001）。Nissl染色结果显示,与Con组相比,LiCl-Pilo组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显减少且体积变小,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）Klotho在大鼠海马神经元表达,不在星形胶质细胞表达。（2）Klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠海马组织中表达下调,可能与TLE大鼠海马神经元损伤及认知功能障碍存在相关性。第二部分Klotho对LiCl-Pilo诱导LTE大鼠行为学及海马神经元损伤的影响目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,探讨klotho在LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知障碍中的作用。方法:本实验分为两部分:（1）大鼠海马注射过表达klotho腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV-KL）转染效率测定的研究:将雄性SD大鼠随机分为仅带有腺相关病毒空载体（AAV-NC）的对照组和AAV-KL组,每组20只。免疫荧光法和WB法检测分别在大鼠海马注射AAV-KL后时间点3w、9w各组大鼠海马klotho转染及蛋白表达情况。（2）Klotho对LiCl-Pilo诱导TLE大鼠癫痫发作的易感性、认知功能及海马神经元损伤的影响:通过海马立体定位注射AAV-KL上调海马内源性klotho的表达,将雄性SD大鼠随机分为分Con组、Saline组、AAV-NC组、AAV-KL组,每组20只,利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型。记录各组大鼠癫痫潜伏期时间和慢性期自发性发作次数（造模后第5周）;造模后第6周采用水迷宫实验评估各组大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况;透射电镜观察各组大鼠海马神经元铁死亡病理学特征;WB法检测各组大鼠海马klotho、GPX-4表达水平;GSH试剂盒和ROS试剂盒检测各组大鼠海马GSH、ROS表达水平;Iron Assay试剂盒检测大鼠海马Fe2+水平。结果:（1）AAV病毒载体转染情况:免疫荧光染色检测结果显示,在注射AAV病毒载体后第3周和9周时,AAV病毒载体均成功转染到海马神经元。（2）klotho表达情况:在海马内注射AAV病毒载体后第3周和9周时,WB法检测结果显示:AAV-KL组较AAV-NC组海马组织中klotho蛋白表达水平均明显上调,且两组之间的统计学差异均具有意义（P<0.001,P<0.01）。（3）行为学结果:Saline组、AAV-NC组、AAV-KL组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟左右,死亡率为13.33%（8/60）。各组大鼠从注射LiCl-Pilo到首次进入4级或以上癫痫发作的潜伏期没有显著差异（P>0.05）。在注射LiCl-Pilo后的第5周,Saline组、AAV-KL组和AAV-NC组分别有90%、80%和90%的大鼠出现自发性癫痫发作,但各组之间大鼠的自发性癫痫发作次数没有显著差异（P>0.05）。（4）大鼠认知行为学研究:水迷宫检测结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠每日找到平台的平均潜伏期明显延长,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠每日找到平台的平均潜伏期明显缩短,差异具有统计学意义（P<0.05）。在空间搜索实验中,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠穿越平台次数明显减少以及在目标象限游泳时间的百分比明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠穿越平台次数以及在目标象限游泳时间的百分比明显增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。在可视化平台期中,各组大鼠找到平台的潜伏期和平均速度,差异均无统计学意义（P>0.05）。（5）大鼠海马神经元损伤情况的研究:HE染色结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区细胞计数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;而AAV-KL组较AAV-NC组相比,细胞染色变浅和模糊不清的特点明显改善,CA1区细胞计数也明显增加,两组统计学差异具有意义（P<0.05）。Nissl染色结果显示,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠CA1区Nissl染色阳性的神经元细胞数明显增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。（6）大鼠海马神经元铁死亡病理特征的研究:透射电镜结果显示:TLE组大鼠海马CA1区线粒体脊减少,外膜破裂,与Con组大鼠比较,Saline组大鼠CA1区细胞线粒体面积减小,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠CA1区细胞线粒体面积增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）大鼠海马组织klotho、GPX-4表达水平:与Con组相比,Saline组大鼠海马klotho、GPX-4的表达水平明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马klotho、GPX-4表达水平明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。（8）大鼠海马组织GSH、ROS表达水平结果:与Con组大鼠比较,Saline组大鼠海马神经元GSH表达均明显下调、ROS表达均明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马神经元GSH表达均明显上调、ROS表达均明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。（9）大鼠海马组织Fe2+水平结果:与Con组大鼠比较,Saline组大鼠海马神经元中Fe2+水平升高,差异具有统计学意义（P<0.01）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠海马神经元中Fe2+水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）Klotho不影响TLE大鼠的癫痫易感性,也不能减轻自发性癫痫发作的次数。（2）Klotho通过减轻海马神经元铁死亡改善TLE大鼠的认知功能障碍。（3）Klotho通过上调海马内GSH、GPX-4水平下调ROS水平及减轻海马内铁沉积抑制TLE大鼠海马神经元铁死亡。第三部分Klotho改善LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知功能障的分子机制目的:利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型,探讨klotho改善LiCl-Pilo诱导TLE大鼠认知功能障的分子机制。方法:通过海马立体定位注射AAV-KL上调海马内源性klotho的表达,将雄性SD大鼠随机分为Con组、AAV-NC组、AAV-KL组、AAV-KL+ML385组,每组20只,AAV-KL+ML385组大鼠给予腹腔注射Nrf2特异性抑制剂（ML385,30mg/kg,连续7天）,利用LiCl-Pilo构建TLE大鼠模型。造模后第6周开始采用水迷宫实验评估各组大鼠认知功能;Nissl染色、HE染色评估各组大鼠海马神经元损伤情况;透射电镜观察各组大鼠海马神经元铁死亡病理学特征;免疫蛋白印迹检测各组大鼠海马Nrf2、FPN、GPX-4表达水平;GSH试剂盒和ROS试剂盒检测各组大鼠海马GSH、ROS表达水平;Iron Assay试剂盒检测大鼠海马Fe2+水平。结果:（1）行为学结果:AAV-NC组、AAV-KL组、AAV-KL+ML385组大鼠在使用LiCl-Pilo诱导SE后均出现Racine分级4级以上发作,发作时间控制在30分钟作用,死亡率为15.00%（9/60）。（2）大鼠认知行为学研究:水迷宫检测结果显示,与Con组大鼠比较,AAV-NC组大鼠每日找到平台的潜伏期明显延长,差异具有统计学意义（P<0.001）;与AAV-NC组相比,AAV-KL组大鼠每日找到平台的潜伏期明显缩短,

摘要译文

关键词：

Klotho; 颞叶癫痫认知功能障碍; 铁死亡; 治疗靶点

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

吴原

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27038/d.cnki.ggxyu.2022.001117