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Temuterkib通过MAPK及Wnt通路调控骨平衡防治骨质疏松的分子机制研究认领

作者：

彭辉

学位授予单位：

广西医科大学

摘要：

目的:通过探究Temuterkib在体外对破骨细胞和成骨细胞分化和功能的的影响,并在体内研究Temuterkib对小鼠卵巢切除骨质疏松模型中调控骨量的作用,进而探讨Temuterkib是一个有价值的治疗骨质疏松的潜在候选药物,为开发针对破骨细胞活性过高引起的相关骨代谢疾病的药物提供科学的研究基础。方法:1.提取C57BL/小鼠的骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow macrophages,BMMs),用核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator protein Kinases lligand,RANKL)诱导,用CCK8试剂盒检测Temuterkib对破骨前体细胞细胞增殖的影响;行抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAcP)染色试剂盒检测分析Temuterkib对破骨细胞分化的影响;在破骨细胞分化的不同时间段加入Temuterkib,用TRAcP染色标记破骨细胞,分析Temuterkib对破骨细胞数量抑制的时间段。应用罗丹明-鬼笔环肽/DAPI对破骨细胞染色,观察不同浓度Temuterkib对伪足小体带形成的影响;予BMMs接种于到骨片,观察Temuterkib对骨吸收功能影响;运用RT-PCR检测Temuterkib对破骨细胞相关基因的表达;免疫荧光染色探究Temuterkib抑制破骨细胞中NFATcl的核转入情况;运用蛋白免疫印迹检测Temuterkib对RANKL诱导的相关骨代谢信号通路的影响,包括NF-ΚB、MAPK等信号通路的影响。 2.成骨细胞用诱导液培养后,用CCK8试剂盒检测Temuterkib对成骨细胞增殖的影响;行碱性磷酸酶染色(ALP)染色,分析其对成骨细胞分化的影响;茜素红染色分析对成骨细胞矿化的影响;运用RT-PCR检测Temuterkib对成骨细胞相关基因的表达,包括RUNX2、ALP、OCN、OPG、COLLA;运用免疫荧光染色检测Temuterkib对骨形成相关的Wnt/β-catenin信号通路的影响。 3.我们构建小鼠卵巢切除(OVX)雌激素缺乏诱导的小鼠骨质疏松模型。Temuterkib治疗结束后,Micro-CT扫描分析测量松质骨骨微结构相关的参数;从H&E和TRAcP染色方面,分析组织形态学变化。结果:1.Temuterkib对BMMs增殖活性没有影响;TRAcP染色证实Temuterkib浓度梯度抑制破骨细胞的生成,Temuterkib可在早、中期抑制RANKL诱导的破骨细胞形成;F-actin染色结果显示,Temuterkib呈剂量依赖性抑制伪足小体带形成;骨吸收实验结果表明Temuterkib呈剂量依赖性抑制破骨细胞骨吸收面积;RT-PCR检测显示,Temuterkib抑制破骨细胞相关基因C-FOS、DC-STAMP、Acp5、CTSK、MMP9及NFATc 1的表达,且呈剂量依赖性;免疫荧光染色证实Temuterkib抑制破骨细胞中NFATc 1的核转入情况。蛋白免疫印迹证实Temuterkib抑制RANKL诱导的BMMs细胞MAPK通路中的JNK的磷酸化,从而抑制下游信号蛋白c-Fos/NFATc1和功能蛋白CTSK的表达。 2.Temuterkib对成骨细胞增值活性没有影响;碱性磷酸酶染色(ALP)证实Temuterkib浓度梯度促进成骨细胞分化。茜素红染色证实Temuterkib浓度梯度促进成骨细胞矿化。RT-PCR检测显示,Temuterkib促进成骨细胞相关基因RUNX2、ALP、OCN、OPG、COLLA的表达,且呈剂量依赖性;Western Blot结果显示Temuterkib激活Wnt/β-catenin信号通路的促进成骨细胞β-catenin、RUNX2蛋白的表达。 3.Micro-CT扫描证实Temuterkib抑制OVX诱导骨丢失;H&E染色证实,Temuterkib改善OVX诱导小鼠组织形态学骨量减少;TRAcP染色证实Temuterkib减少OVX诱导小鼠组织形态学破骨细胞数量。内脏器官病理切片染色分析Temuterkib的对小鼠体内无代谢毒性。结论:Temuterkib通过调控JNK/MAPK信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞形成及骨吸收功能,Temuterkib通过Wnt/β-catenin信号通路的激活,促进成骨细胞分化和成熟,减少OVX导致的骨丢失,调节骨稳态。

摘要译文

关键词：

Temuterkib; 破骨细胞; 成骨细胞; 骨质疏松

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

外科学（专业学位）

导师：

赵劲民

中图分类号：

R580;R58[内分泌腺疾病及代谢病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27038/d.cnki.ggxyu.2022.000046