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LRPPRC通过m6A修饰途径调控三阴性乳腺癌代谢重编程的作用及机制研究认领

作者：

喻远航

学位授予单位：

华中科技大学

摘要：

研究目的乳腺癌新发病例数已超越肺癌,成为全球第一大癌症。三阴性乳腺癌是乳腺癌中最具有侵袭性的亚型,是临床治疗中的一个重要挑战。本研究中发现富含亮氨酸的五肽重复序列基因(Leucine Rich Pentatricopeptide Repeat Containing,LRPPRC)通过N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰途径参与三阴性乳腺癌代谢重编程的调控。因此,本研究旨在将m6A修饰与三阴性乳腺癌代谢重编程联系起来,阐明LRPPRC通过调控乳酸脱氢酶A(Lactate Dehydrogenase A,LDHA)/谷氨酸丙酮酸转氨酶2(Glutamate Pyruvate Transaminase 2,GPT2)的表达参与三阴性乳腺癌代谢重编程的具体分子机制,依此为三阴性乳腺癌的靶向治疗提供新的方向及理论基础。研究方法通过生物信息学数据库筛选出差异表达的LRPPRC作为研究对象。收集本院三阴性乳腺癌患者手术切除的标本,使用Western blot、q RT-PCR和免疫组织化学实验检测LRPPRC的表达;使用比色法m6A RNA甲基化定量检测试剂盒和Dot blot实验检测三阴性乳腺癌中的m6A修饰水平;通过Co-IP实验及细胞免疫荧光实验,检测LRPPRC与m6A修饰位点结合情况。在三阴性乳腺癌细胞中分别通过CCK-8细胞计数实验、EdU细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验检测干扰LRPPRC表达后细胞的增殖能力。通过质谱方法,对转染包含LRPPRC干扰RNA质粒慢病毒的细胞系MDA-MB-231进行代谢组学检测分析。分别使用萤火虫荧光素酶ATP检测试剂盒、基于乳酸分泌检测的比色法细胞糖酵解检测试剂盒、基于2-NBDG探针的细胞葡萄糖摄取检测试剂盒检测干扰LRPPRC表达后细胞的总ATP水平、糖酵解水平以及摄取葡萄糖的水平。通过测序技术寻找LRPPRC通过m6A修饰途径直接调控的下游靶基因。使用分子生物学实验验证LRPPRC直接作用的靶点m RNA—LDHA和GPT2;进一步地利用RNA pull-down技术探究LDAH/GPT2 m RNA m6A修饰位点与LRPPRC蛋白的结合情况;检测干扰LRPPRC后细胞LDAH/GPT2 m RNA半衰期;利用比色法乳酸脱氢酶活性检测试剂盒检测转染后细胞乳酸脱氢酶活性水平。分别通过CCK-8细胞计数实验、Ed U细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验和萤火虫荧光素酶ATP检测试剂盒方法进行拯救实验,进一步地确认LRPPRC通过靶向LDHA发挥生物学效应。分别构建稳定干扰LRPPRC表达的裸鼠异种移植瘤模型,并分别给予小分子抑制剂FX-11、BPTES,观察LRPPRC通过调控LDHA及GPT2在体内对肿瘤生长的影响及机制研究。研究结果 LRPPRC及m6A修饰水平在三阴性乳腺癌中高表达,LRPPRC在细胞质聚集并与m6A修饰位点存在结合。体外细胞实验表明低表达LRPPRC降低细胞糖酵解水平,抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖;过表达LRPPRC增强细胞糖酵解水平,促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。此外,低表达LRPPRC降低三阴性乳腺癌细胞糖酵解水平,可通过增强谷氨酰胺代谢进行能量回补。在分子机制方面,LRPPRC通过m6A修饰途径直接靶向调控LDHA和GPT2的表达。低表达LRPPRC可降低LDHA m RNA的稳定性,下调LDHA的m RNA和蛋白表达水平,同时增强GPT2 m RNA的稳定性,上调GPT2的m RNA和蛋白表达水平。拯救实验表明LRPPRC可通过调控LDHA的表达促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。最后,在LRPPRC过表达/低表达的裸鼠异种移植瘤模型中验证了其在体内对肿瘤生长的促进/抑制作用。研究结论本研究表明,三阴性乳腺癌中显著上调的LRPPRC可通过m6A修饰途径,靶向增强LDHA m RNA的稳定性,增强肿瘤细胞糖酵解,促进细胞增殖。低表达LRPPRC的情况下,LDHA表达降低,糖酵解水平下降,肿瘤细胞生长受到抑制,但与此同时LRPPRC靶向降解GPT2 m RNA的能力降低,GPT2表达升高,肿瘤细胞可通过增强谷氨酰胺代谢进行能量回补。因此,在靶向抑制LRPPRC表达的同时给予谷氨酰胺酶抑制剂可显著抑制肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡,达到合成致死的效应。综上所述,本研究揭示了一种新的m6A修饰“阅读者”—LRPPRC介导的LDHA/GPT2信号轴,在三阴性乳腺癌代谢重编程中通过m6A修饰途径发挥重要的生物学效应。这不仅有助于进一步地了解m6A修饰在三阴性乳腺癌中发挥的重要生物学功能,也阐明了m6A修饰参与肿瘤细胞代谢重编程的角色,更是为LRPPRC作为三阴性乳腺癌潜在的治疗靶点提供了可靠的理论依据。

摘要译文

关键词：

三阴性乳腺癌; 6-甲基腺嘌呤; 代谢重编程; 细胞增殖; 富含亮氨酸的五肽重复序列; 乳酸脱氢酶A; 谷氨酸丙酮酸转氨酶2; 合成致死

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

外科学（普通外科学）（专业学位）

导师：

张波

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]

D O I：

10.27157/d.cnki.ghzku.2022.003862