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药用植物肉苁蓉与其寄主梭梭的寄生特性及机制研究认领

被引量： 2

作者：

缪雨静

学位授予单位：

北京协和医学院

摘要：

肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)是列当科肉苁蓉属多年生全寄生草本植物,其寄主为苋科梭梭属梭梭(Haloxylon ammodendron(C.A.Mey.)Bunge)。肉苁蓉是传统的名贵中药材,也是西北荒漠地区重要的药用经济作物,更是“一带一路”沿线传统植物药代表和关键物种。由于肉苁蓉野生采挖量大,且在梭梭植物上肉苁蓉相对较低的寄生率,导致其野生资源蕴藏量逐渐减少,因此探究肉苁蓉和梭梭的协同适应机理及寄生特性迫在眉睫。本研究从宏观到微观,依托微生物组学-转录组学-代谢组学技术,识别与鉴定水平转移基因、转移代谢物和核心微生物,解析肉苁蓉和梭梭协同进化特征。同时,通过单细胞转录组技术研究肉苁蓉细胞水平上的基因表达空间规律,探究与寄生生长、抗逆和活性成分苯乙醇苷类生物合成途径相关基因在不同细胞类型中的表达模式。主要结果如下:1.肉苁蓉寄生使梭梭根际微生物“寄生减少”。本研究通过对大田土(BULK)、未寄生肉苁蓉梭梭根际土(NCD)和寄生肉苁蓉梭梭根际土(RHA)进行16S和ITS测序分析,发现肉苁蓉的寄生降低了梭梭根际细菌和真菌的群落多样性,简化了共发生网络结构,增加了细菌群落组装机制中属于随机过程的扩散限制比例。溯源分析表明寄生使得BULK 土细菌占梭梭根际细菌群落来源比例从89.1%降低到1.2%;占梭梭根际真菌群落来源比例从3.1%降低到0.5%。2.梭梭微生物在跨域共发生网络中占主导地位。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉、梭梭(ECD&EHA)及其根际土(RCD&RHA)进行16S和ITS测序并分析,发现基于PCoA和PERMANOVA分析,肉苁蓉和梭梭微生物群落差异较小(细菌:R2=0.29971;真菌:R2=0.15631)。在肉苁蓉和梭梭的内生真菌群落中,共鉴定到4个属于梭梭的关键真菌属,1个属于肉苁蓉的关键真菌属。溯源分析发现梭梭微生物群落占肉苁蓉微生物群落的潜在来源比例(细菌:76.5%;真菌34.3%)高于肉苁蓉微生物群落占梭梭微生物群落的潜在来源比例(细菌:52.1%;真菌:16.7%)。3.寄生状态下肉苁蓉和梭梭的微生物群落协同适应。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉、梭梭和吸器部位(PR&HIR&HUR)以及对应根际土(PS&HIS&HUS)样品进行16S和ITS测序并分析,发现吸器部位(HIR&HIS)细菌和真菌群落多样性普遍低于梭梭,但高于肉苁蓉。寄生对于吸器的微生物群落存在影响,7个微生物类群在吸器组织中富集,包括微枝形杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、红色杆菌属、四折叠球菌属、毛壳菌属和青霉属等。共发生网络结构和普鲁克分析结果显示肉苁蓉和梭梭对应的微生物群落具高度一致性。4.肉苁蓉和梭梭间大规模mRNA转移。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行Illumina高通量测序获得转录组数据,构建了肉苁蓉和梭梭foreignmRNA的生物信息学分析流程。在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中分别鉴定到5,480和3,280个foreign mRNA,占整个转录本的11.8%和8.5%;在梭梭根中共鉴定到7,049个foreign mRNA,占整个转录本的23.2%。Foreign mRNA功能富集分析结果显示其可能参与细胞过程和代谢过程等。通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证了 native mRNA 和 foreign mRNA的表达量,结果显示以foreign mRNA表达量显著低于native mRNA,与转录组得到的表达量结果基本一致。5.肉苁蓉和梭梭间特征代谢物转移。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行基于UPLC-Q-TOF-MS技术的代谢组分析。分别在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中鉴定出747和709种化合物;在梭梭根中鉴定出672种化合物。基于OPLS-DA模型的差异代谢物结果表明,肉苁蓉和梭梭的差异代谢物主要集中在次生代谢产物,包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、β-氧化毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷、沙苁蓉苷和管花苷等。值得注意的是,在梭梭根部检测到了肉苁蓉苷A、管花苷C和异毛蕊花糖苷等肉苁蓉属特征成分。Mantel分析结果表明,肉苁蓉中异毛蕊花糖苷、2'-乙酰毛蕊花糖苷和肉苁蓉苷A与转移来的mRNA存在相关性(r=0.2-0.4)。6.肉苁蓉和梭梭间microRNA转移和跨界调控。本研究通过对寄生状态下肉苁蓉鳞叶和肉质茎、梭梭根进行Illumina高通量测序获得转录组数据,构建了肉苁蓉和梭梭foreign microRNA的生物信息学分析流程。在肉苁蓉鳞叶和肉质茎中分别鉴定到13和22个foreign microRNA,占整个microRNA转录本的56.5%和64.7%;梭梭中鉴定到1个foreign microRNA,占整个microRNA转录本的4.5%。microRNA的靶基因预测结果发现,肉苁蓉的foreign microRNA靶基因个数为1,635个,梭梭的foreign microRNA靶基因个数为27个。靶基因功能富集分析结果显示其参与细胞过程和代谢过程等。通过茎环引物法qRT-PCR验证了 native和foreign microRNA的表达量,结果显示肉苁蓉中foreign microRNA表达量略高于native microRNA,而梭梭中foreign microRNA表达量低于 native microRNA。7.肉苁蓉单细胞转录组图谱构建。本研究利用10X Genomics技术对肉苁蓉肉质茎进行单细胞转录组Illumina测序。通过质控和过滤,共得到12,216个高质量细胞,平均每个细胞的UMI(Unique Molecular Identifier)数为2,207,表达的基因数目为1,753。降维聚类分析后,得到10个细胞类群,包括表皮细胞、薄壁细胞、韧皮部细胞、木质部细胞、中柱细胞、分生组织和异形毛状细胞,并开发了多个具有细胞类型特异性的新标记基因。8.单细胞转录组测序揭示肉苁蓉寄生生长、抗逆和次生代谢相关基因表达的空间分布特异性。通过对肉苁蓉单细胞数据进行拟时分析,绘制了维管束细胞和气孔细胞的发育轨迹。结果表明,维管束细胞分化轨迹以维管束类分生组织为起点,到分叉点沿两个方向分化成中柱细胞、木质部和韧皮部细胞。气孔细胞的分化轨迹依次为分生组织母细胞-分生组织细胞-气孔细胞和表皮细胞。植物激素、茎膨大、抗逆和次生代谢相关基因在不同细胞类群的表达谱存在差异。同时,鉴定到了一类寄生植物特有的新细胞类群,该类群中的水平转移mRNA表达量显著高于其他类群。研究结果支持寄生植物与寄主植物间通过吸器交流微生物、遗传物质和代谢物质等来维持两者的“寄生平衡”,所鉴定到的与寄生相关的核心微生物、重要代谢物和遗传物质是寄生形成的重要信号。该研究为特色中药栽培育种奠定基础;为西部关键区域及关键植物类群保护、防风固沙、维护可持续生态系统提供依据,对丰富荒漠植物寄生理论和中药品质生态学理论具有重要科学价值。

摘要译文

关键词：

肉苁蓉; 梭梭; 协同适应; 微生物组; 转录组; 代谢组; 单细胞; 基因水平转移; 跨界调控

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

生药学

导师：

黄林芳

中图分类号：

S567.239;S567.23[多年生⑨]

学科分类号：

0901[作物学];100810[分子生药学]

D O I：

10.27648/d.cnki.gzxhu.2023.000085