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利用硫辛酸探索人类中性粒细胞的谱系决定及相关分子机制认领

作者：

张益萌

学位授予单位：

北京协和医学院

摘要：

背景和目的中性粒细胞是人体外周血中含量最高的白细胞,是固有免疫重要的组成部分。中性粒细胞的缺失会造成严重的感染、昏厥、免疫力低下、高热和寒战等症状。从造血发生角度看,中性粒细胞属于髓系细胞之一,来源于粒系-单核系祖细胞(granulocyte-monocyteprogenitors,GMPs)。多项研究表明 GMPs 是一群具有高度异质性的细胞。尽管已有研究表明在人类骨髓中存在单一潜能的中性粒细胞祖细胞,其表面分子为Lin-CD71highCD117high CD34midCD49dmidCD15lowCD66blow或Lin-CD38+CD71+CD66b+CD15+CD49d+CD11b-。但是,从 GMPs 分化生成 CD66blow/+的单一潜能的中性粒细胞祖细胞过程中细胞表型和中性粒细胞谱系决定过程中细胞转录谱的变化尚不清楚。同时,在这个过程中起调控作用的信号通路也不明确。本研究基于α-硫辛酸(alpha-lipoicacid,ALA)建立的一种可诱导的人中性粒细胞分化缺失模型来研究人类中性粒细胞谱系决定及相关调控机制。研究方法1.利用人脐带血造血干祖细胞(hematopoieticstemandprogenitorcells,HSPCs)和含有 SCF、GM-CSF、IL-3、IL-6、FLT-3L、G-CSF、TPO 等 7 个细胞因子的有血清培养基建立体外人类中性粒细胞和单核细胞的分化体系。通过添加ALA,流式检测其对中性粒细胞和单核细胞分化的影响。2.已知ALA可通过降低ROS水平维持造血干细胞的功能。为确认ALA抑制人中性粒细胞分化是否也与ROS有关,通过在培养基中添加常用抗氧化剂NAC、NAD、VE、VC、GSH和氧化剂双氧水(H2O2),流式检测以上小分子化合物对人脐带血HSPCs向中性粒细胞分化的影响。3.利用流式检测±ALA对人脐带血HSPCs分化CD115-GMPs(Lin-CD34+CD38+CD123+CD45RA+)和 CD115-Lin-CD34-CD38+CD123+CD45RA+的影响;分选CD34high CD115-、CD34midCD115-和 CD34-CD115-通过在培养的起始和第 5 天±ALA,流式检测ALA抑制中性粒细胞生成的阶段。4.流式分析中性粒细胞相关造血祖细胞CD371表达情况,并利用CD371、CD115和CD34分选中性粒细胞祖细胞并通过体外向髓系诱导分化,确定人类中性粒细胞谱系分化的基本路径。5.利用单细胞转录组测序技术(single cell RNA sequencing,scRNA-seq)分析体外来源中性粒细胞谱系分化的转录谱特征,并结合流式细胞术找到中性粒细胞谱系特异性的表面分子。6.通过对成人骨髓细胞进行scRNA-seq,分析验证体内与体外中性粒细胞谱系分化在转录水平是否具有一致性。7.利用ALA对NbP1和NbP2处理48小时后进行转录组测序,通过DESeq2分析差异表达基因并与正常的NbP1、NbP2、NbP3转录谱进行比较,筛选得到人类中性粒细胞谱系分化的潜在调控基因库。通过PCCL过表达载体和plKO.1基因敲低载体,构建不同基因的过表达和shRNA表达载体,并通过体外HSPCs分化体系和体内移植找到调控中性粒细胞生成的关键基因。8.为了研究中性粒细胞分化过程中的ELK1不同转录本(full-length transcript:L-ELK1,short-lengthtranscript:S-ELK1)是如何被剪接的,首先通过RNA-pulldown和蛋白质谱分析寻找与ELK1 RNA结合的剪接因子。随后通过plKO.1对该剪接因子进行敲低,分析其对中性粒细胞谱系分化的影响和对L-ELK1、S-ELK1蛋白表达的影响。9.通过在CD34+HSPCs中过表达L-ELK1和S-ELK1进一步确定L-ELK1和S-ELK1对人类中性粒细胞分化的影响。10.利用过表达L-ELK1和S-ELK1的NbP1进行转录组测序,进一步确定L-ELK1和S-ELK1调控的信号通路。研究结果1.ALA可以特异性阻断人脐带血CD34+HSPCs体外向中性粒细胞的分化。2.ALA抑制HSPCs向中性粒细胞分化并不是通过ROS信号通路。3.ALA严重抑制CD115-CD34high、CD115-CD34mid向中性粒细胞分化,但不能抑制CD115-CD34-向中性粒细胞分化。说明人类中性粒细胞谱系决定是在CD34high向CD34-分化过程中逐渐发生的,同时ALA抑制人类中性粒细胞分化发生在早期CD34+向CD34-分化过程中。4.中性粒细胞来源于CD371+GMPs,且中性粒细胞基本分化路径为由CD115-CD371+CD34high经 CD115-CD371+CD34mid 到 CD115-CD371+CD66b-过程。5.测序结果显示中性粒细胞命运决定的过程中没有明显上调的转录因子,转录后调控可能发挥着重要作用。而CD15在GMPs已开始表达,利用CD15进一步确定Lin-CD73/CD1c/CD1 16/CD115-CD38+CD123+CD45RA+CD371+细胞群中人中性粒细胞分化的三个阶段:CD34+CD15-中性粒细胞偏好性祖细胞1(neutrophil-biased progenitor 1,NbP1)、CD34midCD15mid NbP2 和 CD34-CD15+NbP3。6.测序结果验证了体内与体外中性粒细胞分化路径具有一致性,同时也解析了体内中性粒细胞谱系分化过程中的转录谱特征。7.ELK1是调控中性粒细胞生成的关键基因,敲除ELK1后人类中性粒细胞分化受阻,其表型和添加ALA相同。8.SF3B1是调控L-ELK1和S-ELK1表达的关键剪接因子。同时,ALA可以增强与SF3B1与ELK1 RNA的结合。SF3B1-ELK1信号通路在人类中性粒细胞谱系分化中起关键调控作用。9.过表达L-ELK1后人类中性粒细胞分化被阻滞在CD34-CD15+NbP3阶段。同时,敲低L-ELK1后中性粒细胞分化受阻,单核细胞比例显著上升。而过表达S-ELK1可少量增加中性粒细胞生成,敲低S-ELK1则使中性粒细胞生成明显减少。10.L-LKE1和S-ELK1调控的是酶颗粒合成和运输的不同阶段相关基因。L-ELK1上调酶合成(CTSS、CTSB、CSTB、HEXB、FUCA1、PRCP等)和内质网对高尔基体转运相关基因(COPA、COG6、GOLGB1、BET1、LMAN1、USO1、VAPA、BET1等),而S-ELK1上调高尔基体转运相关基因(SEC24A、SEC23IP和KIF3A)、催化反应和酶成熟相关基因(LTN1、TRIM37、TRIM71、LOXL1等)。研究结论我们通过ALA建立了可诱导的人类中性粒细胞体外分化缺失模型,并通过该模型解析了 GMPs向中性粒细胞谱系分化的基本过程。同时也找到了调控中性粒细胞谱系分化的关键调控信号通路,即SF3B1-ELK1信号通路。

摘要译文

关键词：

中性粒细胞; 单核细胞; 谱系决定; ALA; ELK1; SF3B1

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

免疫学

导师：

马峰

中图分类号：

R392[医学免疫学]

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学]

D O I：

10.27648/d.cnki.gzxhu.2022.000877