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自身免疫性肝炎的临床研究及中性粒细胞参与其致病的机制初探认领

作者：

沈怡

学位授予单位：

四川大学

摘要：

目的: 自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是免疫异常介导的靶向肝细胞的肝脏实质炎症。根据患者生化指标(总胆红素、转氨酶)的不同,常分为慢性表现AIH、急性表现AIH。临床上可见隐匿起病、体检发现肝功能异常,或因肝硬化原因不明就诊的慢性表现AIH患者。此外,也常见到肝功能急剧恶化、出现明显黄疸、甚至快速进展为肝衰竭的急性表现AIH患者。但目前国际上对于急慢性表现AIH的分型标准、治疗后应答以及预后,尚没有完全统一的阐述。本研究拟从发病时间、生化指标、肝纤维化病理分期、影像学四个方面来探讨不同分型AIH的临床特点,并比较不同分型AIH在治疗、预后方面的差异。而关于AIH的发病机制,目前尚未完全阐明,可能与遗传易感性、环境因素触发、免疫耐受破坏等相关。现有研究更多关注的是T淋巴细胞(Th1细胞、调节性T细胞等)相关的适应性免疫在AIH中发挥的作用。我们既往的研究已发现AIH患者肝脏有较多中性粒细胞浸润,而中性粒细胞作为固有免疫细胞中数量最多的一类,其在AIH中是否发挥致病作用目前尚无明确阐述。因此本研究拟进一步求证中性粒细胞是否参与AIH致病,并探索其可能的致病机制。材料和方法: 本研究筛选了 2012年7月至2019年12月至本中心就诊并怀疑AIH的患者208名,按照严格的入组标准(包括发病时间、肝功能指标、肝脏病理S分期、有无影像学肝硬化)进行病例纳排,并按急慢性标准将这些患者分为四型(急性AIH、慢加急性AIH、早期慢性AIH、进展期慢性AIH)。首先比较四组患者基本信息、生化指标、肝脏病理炎症分级、血浆细胞因子等差异,然后根据随访结果比较组间免疫抑制治疗后的应答差异,并在不同时间点描绘各组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、免疫球蛋白G(IgG)的变化探索组间生化缓解模式的差异。并根据组间比较的差异进行比例风险(COX)回归分析,预测影响AIH完全生化缓解(fullbiochemicalremission,FBR)的危险因素。最后总结复发、死亡患者所属的AIH分型、治疗特点以及死亡原因。进一步的基础研究中,首先进行中性粒细胞相关标志物CD66b(人中性粒细胞表面经典标志物,一种糖基磷脂酰肌醇关联蛋白)、CD177(主要表达于不同发育阶段的中性粒细胞,一种糖基磷脂酰肌醇锚定的糖蛋白),以及血浆Luminex液相芯片检测出的差异细胞因子IL-10的人肝脏免疫组化染色。然后根据已检测到的血浆差异细胞因子,进行重组细胞因子体外处理中性粒细胞,探索可能影响AIH患者体内中性粒细胞存活的细胞因子。随后进行刀豆蛋白A(ConA)小鼠造模形成实验性自身免疫性肝炎(EAIH),通过检测造模小鼠的肝功能、肝脏病理表现证实模型的可用性。然后使用Ly6G(小鼠中性粒细胞表面经典标志物,一种糖基磷脂酰肌醇关联蛋白)中和抗体、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等治疗性干预措施进行体内实验探索中性粒细胞在EAIH中的作用。接着从造模小鼠肝脏提取中性粒细胞进行荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、蛋白质免疫印迹(WB)等实验探索中性粒细胞参与调控EAIH可能的信号通路。同时我们还通过多功能酶标仪检测人血浆、小鼠血清细胞游离DNA(cfDNA),通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血浆α干扰素(IFN-α),通过流式检测人外周血中性粒细胞活性氧(ROS)释放等进行信号通路上下游相关分子的探索。最后,结合qPCR实验中发现的ConA造模小鼠肝脏里中性粒细胞高表达的基因,我们使用Toll样受体9(TLR9)杂合突变鼠、白介素-6(IL-6)基因敲除鼠进行造模求证中性粒细胞调控AIH可能的信号通路;并结合其他研究提及的CD177+中性粒细胞与部分炎症疾病的相关性,我们使用CD177基因敲除小鼠造模进一步求证CD177+中性粒细胞与AIH炎症是否相关,及其在AIH炎症中所起的作用。同时,本研究前瞻性地收集了 AIH患者治疗前的外周血中性粒细胞进行流式细胞学及qPCR检测,然后进一步分选正常人和AIH患者外周血CD177+、CD177-中性粒细胞进行mRNA测序。测序后通过GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库进行基因功能、通路的富集分析,比较两种细胞在功能、信号通路方面的差异;并通过韦恩图找出疾病及健康状态下两种细胞均存在差异的基因交集,再通过聚类分析选出差异基因交集中两种细胞表达差异最明显的基因进行qPCR验证,从而进一步明确CD177+、CD177-中性粒细胞在AIH中的作用是否不同。结果: 本研究最终纳入AIH确诊患者133名,其中慢加急性AIH患者占64.7%,进展期慢性AIH占24.1%,急性AIH仅占9%,而早期慢性AIH只占2.2%。四种分型的AIH患者在发病时间、影像学肝硬化、血小板、肝功能、凝血功能、NUDT15基因型、肝脏病理炎症分级等临床指标方面存在明显的统计学差异。血浆细胞因子IL-10在急性AIH患者中明显升高(P<0.01),IFN-γ也有升高趋势(P=0.07)。在44.3个月的中位随访时间中,四组AIH患者的FBR率虽没有统计学差异,但我们发现急性AIH和早期慢性AIH患者在随访结束时均已实现FBR,而具体的生化缓解时间在四组患者之间其实有所不同。急性AIH组患者在治疗3月后的FBR率为66.7%,明显高于慢加急性组(32.6%)、进展期慢性组(21.9%);而在治疗后6月,急性AIH组患者的FBR率为75%,明显高于进展期慢性组(31.3%),上述两个时间点的差异均具有统计学意义(P=0.02、P=0.04)。早期慢性AIH组患者治疗3月后的FBR率与急性AIH组相同,但由于该组病例数少,因此与其他组相比无统计学差异。而本研究中已实现FBR的患者,无论其属于哪种分型的AIH,实现FBR所需的时间均未超过3年。COX回归分析结果显示IgG、NUDT15杂合突变、切换二线治疗是影响FBR的独立危险因素。预后相关事件总结发现,死亡、肝移植病例均来自慢加急性AIH组和进展期慢性AIH组。进一步,结合我们既往发现的AIH患者肝脏存在中性粒细胞浸润的现象,我们进行了AIH患者肝脏中性粒细胞相关标志物的免疫组化,结果显示AIH患者肝脏CD66b、CD177阳性细胞比例较正常肝脏更高(P=0.01、P=0.05);而结合患者血浆中已发现的差异细胞因子IL-10,进行人肝脏IL-10免疫组化,结果也显示AIH患者肝脏IL-10阳性比例较正常肝脏更明显(P<0.01)。随后的细胞因子体外处理中性粒细胞实验中可见IL-10刺激后的中性粒细胞凋亡减少(P<0.05),IFN-γ处理后也有相似趋势(P=0.09)。然后使用ConA小鼠造模成功模拟AIH,进一步通过腹腔注射Ly6G中和抗体消耗小鼠体内的中性粒细胞后再进行小鼠ConA造模,发现其肝功能较单纯造模组明显改善(P<0.05);而小鼠腹腔注射G-CSF后再进行ConA造模,其生存情况变差、肝功能也较单纯造模小鼠有更差的趋势。然后提取ConA造模小鼠肝脏中性粒细胞进行的信号通路研究发现,造模鼠肝脏中性粒细胞的TLR2、TLR9、JUN、IL-6、IRF7等基因的转录水平较ConA肝脏、对照肝脏增高。检测发现造模小鼠血清、AIH患者血浆cfDNA均明显升高(P<0.01),患者外周血中性粒细胞ROS释放在生化缓解后明显减少(P<0.05),而作为IRF7下游炎性细胞因子之一的IFN-α,它在AIH患者外周血中性粒细胞中的转录水平明显增高(P<0.01),并在患者治疗前的血浆中有升高趋势,在患者FBR后的血浆中有下降趋势。此外,除了免疫组化结果显示患者肝脏CD177阳性细胞比例较正常肝脏增高外,人外周血中性粒细胞流式分析结果也显示AIH患者CD177+中性粒细胞比例较健康对照更高(P<0.05)。于是进一步敲除小鼠IL6、CD177基因以及使用TLR9基因杂合突变小鼠分别进行造模,发现IL6基因敲除鼠以及TLR9基因杂合突变鼠C onA造模后肝脏炎症减轻,而CD 177基因敲除鼠造模后肝脏炎症明显加重。随后分选AIH患者以及健康对照的外周血CD177+、CD177-中性粒细胞进行mRNA测序、分析及qPCR验证,结果显示患者体内两种细胞存在G-蛋白偶联受体活性等分子功能差异,而在健康对照体内两种细胞的差异主要在于颗粒构成等结构上;通过基因聚类分析找出了无论是在患者还是健康对照中均存在的两种细胞的基因表达差异,即CD177+中性粒细胞在CEBPE、IL1RL1、ARL4C、HRASLS5、UTG2B11基因的转录水平上较CD177-中性粒细胞表达更低,扩大样本进行qPCR验证的结果也与测序一致。结论: 本研究发现慢加急性AIH是AIH最主要的疾病分型,而不伴肝纤维化的早期慢性AIH十分少见。四种分型的AIH在临床特征上有所差别,且各型AIH的生化缓解模式并不相同。急性AIH、早期慢性AIH实现FBR更快,预后可能更好。进一步的基础研究证实了中性粒细胞参与AIH致病,并可能通过TLR信号通路、ROS释放发挥调控作用。此外,CD177+中性粒细胞在AIH患者以及EAIH中均有增多,敲除小鼠CD177基因后行ConA造模发现肝脏损伤加重,故推测CD177+中性粒细胞在肝脏炎症中起保护性作用。

摘要译文

关键词：

自身免疫性肝炎; 分型; 治疗应答; 中性粒细胞; CD177

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

内科学（消化）（专业学位）

导师：

杨丽

中图分类号：

R575.1[肝炎⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27342/d.cnki.gscdu.2022.003334