瘦素在癫痫神经发生和认知功能中的作用及相关机制探索-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

瘦素在癫痫神经发生和认知功能中的作用及相关机制探索认领

作者：

陈曼

学位授予单位：

四川大学

摘要：

目的: 癫痫患者常常伴有认知功能减退。频繁的痫性发作和神经发生损害是导致癫痫患者认知功能障碍的重要原因,但具体发病机制仍不清楚。由于成体海马神经发生在学习和记忆中起着至关重要的作用,异常神经发生可能成为治疗癫痫相关认知功能障碍靶点。通过清除癫痫发作诱导的异常新生颗粒细胞或者移植神经干细胞（neural stem cells,NSCs）和间充质干细胞源性外囊泡,修复或者重建癫痫动物模型大脑中的神经回路并促进正常的神经发生为治疗癫痫相关认知功能障碍带来了曙光。然而,既往的研究尚未阐明癫痫患者大脑中的病理改变如何导致成体神经发生失调和认知功能减退。探究癫痫发生过程中影响神经发生的分子机制,对于有效地从内源性或者外源性NSCs的角度调控神经发生是至关重要。研究显示,脂肪细胞衍生的瘦素（leptin,Lep）参与突触可塑性和神经发生过程的调控过程。大脑内leptin的相对缺乏会导致神经内分泌功能障碍和肥胖。抑制leptin的活性或减少leptin的表达均可导致阿尔茨海默病和抑郁症模型动物海马中神经发生减少。癫痫相关的大脑内病理改变与leptin信号也存在内在联系。研究者发现,匹罗卡品（pilocarpine,Pilo）诱导的癫痫大鼠在慢性期体重明显增加并出现肥胖,海马组织中代谢相关基因的表达水平也发生改变。Leptin干预能够降低未成熟脑癫痫发作易感性。我们课题组及其他研究小组的前期研究结果均显示颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）患者血清中的leptin水平较健康人增加,部分存在leptin抵抗。此外,在临床工作中,我们也观察到难治性癫痫（drug-resistant epilepsy,DRE）患者肥胖比例相对较高。但是,leptin及leptin信号分子在癫痫患者脑内表达水平的改变以及对神经发生的具体影响尚不明确。基于leptin在癫痫和神经发生过程具有重要作用的研究证据,我们推测癫痫发作可能导致leptin信号转导损害,扰乱海马中NSCs的微环境,进而导致神经发生异常和认知功能障碍。因此,在本研究中,我们首先通过临床研究探讨肥胖与癫痫的相关性,然后通过构建癫痫动物模型探讨leptin在神经发生和认知功能中的作用及分子机制,旨在寻找潜在的干预靶点。材料和方法: 本研究收集2015年1月至2020年3月在四川大学华西医院神经内科就诊的癫痫患者。通过卡方检验和方差分析方法分析超重和肥胖的癫痫患者在人口学特征,临床特征和病理学改变等之间的差异。通过多因素Logistic回归调整混杂因素分析癫痫患者肥胖的相关因素。研究选取6-7周健康雄性SD大鼠137只,随机分为Sham组和Pilo组。采用氯化锂-匹罗卡品诱导构建大鼠癫痫模型。在大鼠诱导癫痫持续状态（status epilepticus,SE）后的第一天,将造模成功的大鼠随机分为安慰剂组（Pilo+Veh）和腹腔注射leptin（1 mg/kg/d）干预组（Pilo+Lep）至SE后第7天。在SE后第三天,随机对三组中其中一半的动物按照每日2次进行Brd U（50 mg/kg）腹腔注射至SE后第7天,用于标记NSCs。监测大鼠体重并分别收集SE后3天,7天,14天,35天及50天大鼠海马组织和血清样本。实验过程中:（1）采用ELISA方法检测大鼠血清中的leptin浓度;（2）采用Western blot和免疫组织化学染色分析癫痫发生过程中海马中的leptin信号分子的表达水平及分布的差异;（3）采用水迷宫实验和Western blot评估大鼠的空间记忆能力;（4）采用q PCR检测海马神经发生相关标志物的转录水平;（5）采用Brd U免疫荧光染色分析NSCs的增殖和迁移情况;（6）通过检测大鼠海马中成熟神经元标记物（Neu N）,神经胶质细胞标记物（GFAP/S100β）,未成熟神经元标记物（DCX）和Brd U免疫共标记的细胞数目分析大鼠海马中NSCs分化的细胞谱系的改变;（7）采用尼氏染色评估神经元细胞存活情况;（8）采用免疫组织化学染色检测Reelin+中间神经元数目评估颗粒细胞的异位迁移。此外,我们在SE后35天提取了Sham组,Pilo+Veh组和Pilo+Lep组的大鼠海马组织中的RNA进行RNA-Seq分析,探究leptin干预对癫痫大鼠神经发生和认知功能调控在转录水平的影响。最后,通过q PCR,Western blot方法及脂质氧化物水平的测定对相关机制进行验证。结果: 癫痫患者超重和肥胖的特点:研究中共纳入1617名癫痫患者。我们发现未经治疗新诊断癫痫,接受丙戊酸治疗,多药联合治疗和难治性癫痫（drug-resistant epilepsy,DRE）患者超重和肥胖的综合比例相对较高。多因素Logistic回归分析提示DRE与癫痫患者肥胖具有相关性。癫痫发作诱导海马神经发生异常和认知功能障碍:（1）Brd U荧光染色结果显示:与Sham组比较,在SE后7天和14天海马DG区中的Brd U阳性细胞数增加,但在SE后35天Brd U阳性细胞数较前期明显下降。SE后14天,Pilo组的大鼠海马中较多的新生颗粒细胞迁移至DH区,CA1区和CA3区。（2）Brd U/Neu N和Brd U/GFAP荧光染色双标的结果显示:在Pilo组内,Brd U+Neu N+细胞数以及Brd U+Neu N+占Brd U+细胞百分比从SE后7天开始出现持续性下降（P<0.0001）。然而,相对于Sham组,Brd U+GFAP+的数量占Brd U+细胞数比例在SE后14天短暂减少后（P=0.0783）,在SE后35天Brd U+GFAP+细胞所占比例显著增加（P=0.0004）。（3）水迷宫实验结果提示Pilo组大鼠的空间记忆能力减退,但无明显的运动功能差异。癫痫发作导致海马中leptin信号转导受损:（1）大鼠海马组织的Western blot结果分析结果显示:Leptin仅在SE后7天表达水平较Sham组增加（P=0.0030）,我们也未发现Lep R在各组大鼠海马中的表达水平具有差异性。然而,Pilo组大鼠海马中的p-Lep R（活化的Lep R）表达水平随着时间增加而降低,在SE后14天（P=0.0028）,35天（P=0.0004）和50天（P<0.0001）均显著低于Sham组。进一步检测leptin信号通路下游p-Stat3,p-Akt的表达水平（作为Lep R活性附加指标）:相对于Sham组,p-Stat3在SE后3天（P=0.0233）和SE后7天（P<0.0001）表达水平增加,在SE后14天和35天表达减少。p-Akt的表达水平在SE后14天,35天和50天均减少。Pilo组内比较分析发现,海马中的p-Stat3和p-Akt的相对表达水平在SE后14天开始随着时间增加而逐渐降低。（2）p-Lep R免疫组织化学染色结果显示:在SE后35天,Pilo组和Sham组中的大鼠海马CA1,CA3和DG区的神经细胞中均有p-Lep R免疫反应阳性,提示海马区存在Lep R的表达。与Sham组比较,Pilo组大鼠海马DG区和CA1区中的p-Lep R免疫阳性的神经细胞数量较少。 Leptin影响癫痫大鼠海马神经发生和认知功能:（1）大鼠体重监测和血清leptin浓度检测结果显示:与Sham组相比,Pilo+Veh组大鼠在SE后1天至9天内体重下降明显。Pilo+Lep组与Pilo+Veh组的大鼠体重相比,在SE后19天至27天体重偏低。尽管在SE后28天至35天,Pilo+Veh组大鼠的体重有增加趋势,但三组之间无统计学差异。在ELISA实验中,我们发现在SE后35天,Pilo+Veh组和Pilo+Lep组大鼠血清中的leptin浓度较Sham组增加,但未发现Pilo+Veh组和Pilo+Lep组间具有差异性。（2）Brd U荧光染色结果显示:在SE后7天,Pilo+Lep组与Pilo+Veh组比较,大鼠海马DG区的Brd U阳性细胞数量无差异。在SE后35天,与Pilo+Veh组比较,发现Pilo+Lep组大鼠海马中的Brd U标记的细胞数明显增加（P=0.0051）。（3）q PCR实验分析海马神经发生相关基因的表达水平,结果显示:相对于Pilo+Veh组,leptin能够增加癫痫大鼠海马组织中Neu N基因的表达水平,降低GFAP基因的表达水平,但未发现Nestin基因在组间的表达水平的差异性。（4）在SE后35天,Brd U/Neu N,Brd U/DCX,Brd U/GFAP和Brd U/GFAP/S100β荧光染色共标的结果显示:Pilo+Veh组中的Brd U+Neu N+细胞数（P=0.0055）,Brd U+DCX+细胞数（P=0.0008）和Brd U+Neu N+细胞数占Brd U+细胞数的比例（P=0.0131）均低于Pilo+Lep组。然而,Pilo+Veh组中的Brd U+GFAP+细胞数目和Brd U+GFAP+细胞数占Brd U+细胞数的比例却显著增加,与Brd U+GFAP+S100β+细胞数及所占Brd U+细胞数比例的分析结果一致。（5）尼氏染色结果显示:相对于Sham组,Pilo+Veh组大鼠海马区的部分椎体神经元核溶解,其中CA1和CA3区神经元显著丢失。Leptin干预后在一定程度上修复了癫痫大鼠的海马结构,CA3区的神经椎体细胞变性丢失数量减少（P=0.0471）。（6）Reelin免疫组织化学染色结果显示:与Pilo+Veh组比较,Sham组（P=0.0287）和Pilo+Lep组（P=0.0101）的大鼠海马DH区中Reelin+中间神经元数目增加,提示leptin减少了新生颗粒细胞的异常迁移。（7）水迷宫实验和Western blot结果显示:Leptin能够改善癫痫模型大鼠的空间记忆能力并降低p-Tau的表达水平。 Leptin调控能量代谢和减轻氧化应激:（1）海马组织的RNA-Seq分析结果显示:Sham和Pilo+Veh组比较发现有735个表达具有差异的基因。差异基因中表达上调的有601个,表达下调的基因有134个。GO功能富集分析结果显示,癫痫发作诱导神经细胞凋亡,神经胶质细胞激活,活性氧的代谢和Akt信号转导相关通路的基因表达上调。Pilo+Veh和Pilo+Lep组比较,有1348个表达具有差异的基因。差异表达基因中表达上调的有494个,表达下调的有854个。KEGG信号通路分析和GSEA富集分析均显示leptin干预后能量代谢过程,突触可塑性相关蛋白质合成和神经发生通路相关基因的表达发生改变。（2）基因功能富集分析揭示了代谢相关基因的显著改变,基于前期结果,我们分析了RNA-Seq数据中能量代谢过程包括糖异生,糖酵解,TCA循环和脂肪酸代谢相关基因的具体表达变化。癫痫发作导致大鼠海马中脂肪酸代谢,TCA循环和糖异生代谢过程失调。然而,参与糖酵解过程关键酶的编码基因的表达上调包括:HK2,Aldh2,Aldh3,Pfkfb3,Hif1α,Eno1,Pgk1和Pgm1。Leptin干预后参与糖酵解过程相关基因表达相对下调,脂肪酸代谢过程尤其是脂肪酸β氧化过程相关基因表达上调包括:Acaca,Acacb,pparα,Fasn,Acsl1,Hadhα,SLC27a,SLC22a,Cpt1α和Cpt1b。TCA循环过程的相关分子:Ogdh1,Gls2,Aco2,Aco1,Mdh1和Pdha1在Pilo+Lep组的表达也相对上调。但我们未发现leptin影响糖异生代谢过程。（3）我们进一步分析了与能量代谢密切的线粒体功能相关指标。q PCR分析结果显示,线粒体生物发生的标志物PGC-1α和Tfam在转录水平无明显改变。检测调控线粒体融合Mfn1和Mfn2以及线粒体分裂的分子Fis1和Drp2在转录水平的表达水平,发现Mfn1的表达水平在leptin干预后显著增加（P=0.0048）。在蛋白水平上,Mfn1分子在Pilo+Lep组的表达也上调（P=0.0450）。（4）我们测定了反映氧化应激程度的脂质氧化物水平。

摘要译文

关键词：

癫痫; 共患病; 认知功能; 神经发生; 瘦素

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学

导师：

何俐

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27342/d.cnki.gscdu.2022.001582