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樟脑基荧光探针的合成及其对疾病微环境影响因子的响应与生物成像研究认领

作者：

张燕

学位授予单位：

南京林业大学

摘要：

生物体内存在着各种各样的活性物质,例如次氯酸、亚铁离子等,它们参与了人体内许多重要的生物化学进程。但这些活性物质在生物体内的浓度异常会导致代谢功能紊乱等病理状态,进而可能诱发诸如阿尔兹海默症、心血管疾病等多种疾病。细胞微环境是细胞通过处理各种生物信号以及对环境产生影响来进行交流的局部环境,其参数包括了pH值、黏度等。细胞微环境与细胞信号转导、能量传递、代谢速率调控等多种生理过程密切相关,其表达异常会诱发动脉粥化、糖尿病、甚至肿瘤等多种重大疾病。因此,需要开发有效的方法对这些疾病相关因子进行简单、直观、精确的监测。小分子荧光探针由于具有结构可调控、响应灵敏、实时监测及可视化分析等优点,在细胞与组织成像、临床诊断与治疗等领域显示出极大的应用潜力。樟脑是重要的松节油初级衍生物,具有分子刚性强、生物相容性好、可修饰性强、细胞毒性低、价格低廉、绿色环保等诸多优点。为了实现生物体内几种疾病相关因子的灵敏检测,本文以樟脑为起始原料,设计合成了5种具有良好光学性质和检测性能的新型小分子荧光探针,并研究了其在生物体内的成像性能,为开发相关疾病早期诊断的方法提供了良好的理论依据,同时也为拓展松节油的利用新领域提供了实践经验。主要的研究内容和结果如下: （1）以樟脑为原料,基于螺吡喃闭开环策略构建了一种能够同时检测pH和黏度的双功能探针1,7,7-三甲基-3-(（1',3',3'-三甲基螺[苯并吡喃-2,2'-吲哚啉]-6-基）亚甲基)双环[2.2.1]庚-2-酮（2Ⅲ）。在pH 7.14～12.41范围内,随着体系碱度的增加,探针溶液的绿色荧光逐渐增强,且裸眼观察到溶液由淡蓝紫色变为豆绿色,计算得到p Ka值为10.25。通过选择性、光稳定、可逆性实验研究表明,探针2Ⅲ可专一地、稳定地、可逆地对OH-进行响应。探针在高黏度体系中呈现橙红色,在1.14～627.5 c P黏度范围内,荧光强度随着黏度的增加而增强,具有很高的灵敏性,并且探针2Ⅲ对黏度的检测不受溶剂极性和光照的影响。此外,将探针2Ⅲ成功应用于活细胞中pH和黏度的检测和荧光成像。（2）以中间体3-（3'-甲酰基-4'-羟基苯亚甲基）-1,7,7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮（2Ⅱ）为原料,引入吡啶基作为H+的识别位点,构建了一种pH响应型荧光探针3-（吡啶-4-基）-6-(（4,7,7-三甲基-3-羰基双环[2.2.1]庚-2-亚基）甲基)-2H-苯并吡喃-2-酮（3Ⅰ）。在pH3.19～7.54范围内,随着体系酸度的降低,探针溶液的荧光由蓝色变为亮黄色,且探针3Ⅰ的荧光强度比(F445 nm/F373 nm)与pH（4.34～5.92）呈线性相关,计算得到p Ka值为5.14。该探针对H+具有快速响应、选择性高、稳定性好、可逆性好的检测优势。此外,探针3Ⅰ具有定位溶酶体的能力,能成功用于监测氯喹刺激下溶酶体中pH值的变化。（3）以樟脑为原料,通过羟醛缩合和氧化反应合成了具有N+-O-结构的荧光探针N,N-二甲基-4-(3-（4,7,7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基）丙-1-烯-1-基)氧化苯胺（4Ⅱ）,利用Fe2+的还原特性,使N-氧化物单元被还原成三级胺,实现探针对Fe2+的“关-开”型识别。探针有很大的斯托克斯位移（～208 nm）,有利于避免荧光自吸收的干扰。与Fe2+（0～20μM）作用后,探针溶液在日光下从无色变为黄色,荧光颜色从无色变为红色,且在603 nm处的荧光强度与测试范围内Fe2+浓度具有良好的线性关系,检测限低至8.3 n M。该探针能明显将Fe2+和Fe3+进行区分,相比络合型Fe2+探针具有更高的选择性。此外,探针实现了多种应用,不仅提供了一种在滤纸上检测Fe2+的简便方法,而且成功应用于监测铁死亡模型下活细胞和斑马鱼幼鱼中Fe2+浓度的波动。（4）以中间体2Ⅱ为原料,引入芳基硼酸酯为识别位点,构建了一种首次实现双模式检测Cl O-的荧光探针2-（2-苯并噻唑基）-3-(2-(4-（4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁硼烷-2-基）苯甲氧基)-5-（樟脑-3-甲烯基）苯基)丙烯腈（5Ⅱ）。在低浓度Cl O-（0～45μM）范围内,探针溶液的绿色荧光逐渐增强,在485 nm处的荧光强度与Cl O-浓度具有良好的线性关系;在高浓度Cl O-（45～80μM）范围内,探针溶液的荧光由绿色变为红色,荧光强度比(F633 nm/F485nm)与Cl O-浓度具有良好的线性关系,计算得最低检测限为8.6 n M。该探针实现了结合关-开型和比率型两种检测模式对不同浓度的Cl O-进行灵敏、精准、可靠的识别。该探针还具有选择性好、反应迅速、pH适用范围广和低毒性的特点,能够在活细胞和斑马鱼中对外源性和内源性的Cl O-进行原位和实时成像。（5）以樟脑为原料,合成了具有良好荧光性质的嘧啶衍生物4-（4'-吡啶基）-8,9,9-三甲基-5,6,7,8-四氢-5,8-桥亚甲基喹唑啉-2-胺（6Ⅱ）,再通过取代反应引入芳基硼酸作为Cl O-的识别位点构建了荧光探针4-（2-氨基-8,9,9-三甲基-5,6,7,8-四氢-5,8-亚苄基喹唑啉-4-基）-1-（4-二羟硼基苄基）溴化吡啶（6Ⅲ）,所形成的吡啶盐结构不仅极大地提高了探针的水溶性,而且成为定位线粒体的靶向基团。在纯水相体系中,探针呈橙红色荧光,与Cl O-作用后,荧光发射发生明显蓝移,呈蓝色荧光,同时,裸眼观察到溶液从黄色变为无色,因此探针可以作为比色型和比率型Cl O-荧光探针。在0～75μM的Cl O-浓度范围内,荧光强度比(F438 nm/F568 nm)与Cl O-浓度呈良好的线性关系,计算得检测限为5.95 n M。此外,探针能够迅速地在生理pH范围内对Cl O-作出专一性响应。同时,探针不仅可以监测细胞线粒体中外源性和内源性Cl O-的浓度变化,而且成功在斑马鱼体内对急性肝损伤模型下产生的Cl O-进行比率型监测。

摘要译文

关键词：

樟脑; 荧光探针; 生物活性分子; 细胞微环境; 荧光成像

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

林产化学加工工程

导师：

王石发

中图分类号：

R313[医用化学];O657.3[光化学分析法（光谱分析法）⑨]

学科分类号：

1001[基础医学];100601[中西医结合基础医学];070302[分析化学];070306[化学生物学];081704[应用化学];081706[分子化工]

D O I：

10.27242/d.cnki.gnjlu.2022.000933