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白细胞介素-35在破骨细胞分化和胶原诱导性关节炎骨破坏中的作用认领

被引量： 1

作者：

袁琳

学位授予单位：

中国医科大学

摘要：

目的:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种病因不明的慢性系统性炎症性疾病,其核心特征为受累部位滑膜异常增生、慢性滑膜炎症以及软骨和骨组织不可逆的侵蚀、破坏。70%的RA患者在发病2年内会出现不同程度的骨质疏松及骨破坏,重者可出现病理性骨折或身体残疾,严重影响生活质量。大量研究表明,多种因素参与下的破骨细胞(Osteoclast,OC)功能异常活化是RA骨破坏的始动因素。OC源自骨髓单核巨噬细胞系统,能够溶解骨组织是其独特的本领,因其可以通过向骨表面迁移、对骨质进行侵袭和吸收,而成为了RA患者发生骨质疏松和骨破坏的“元凶”。因此针对OC分化和功能的相关研究是预防和治疗RA骨破坏的关键。白细胞介素(Interleukin,IL)-35在多个自身免疫疾病中扮演重要角色。现有研究表明,IL-35在RA的病理过程中发挥负向调控作用。我们研究小组发现IL-35可以通过下调核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)、上调骨保护素(osteoprotegerin,OPG)的方式参与骨代谢调节。同时,IL-35还能够抑制成熟OC的增殖、促进其凋亡。也有文献报道,IL-35可通过NF-κB通路抑制成熟OC所致的骨陷窝形成。但目前针对IL-35在OC形成和分化过程中作用的研究尚不够深入,因此本研究中,我们通过体外诱导RAW264.7细胞系生成OC和建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型,探讨IL-35对OC分化的影响及在CIA模型骨破坏中扮演的角色和相关机制,为临床RA合并骨破坏的预防和治疗提供依据。方法:1、选用小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株RAW264.7作为OC前体细胞,加入不同浓度IL-35(0、25、50、100、150及200ng/ml)及RANKL和巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage Colony Stimulating Factor,M-CSF)共同诱导成熟OC。(1)Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测不同浓度IL-35对RAW264.7细胞活性的影响;(2)用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色来评估不同浓度IL-35对RANKL及M-CSF诱导RAW264.7细胞向OC分化的影响;(3)Transwell小室方法检测不同浓度IL-35对OC迁移和侵袭能力的影响;(4)采用RT-PCR和Western-blot方法检测不同浓度IL-35对OC分化相关标志性基因及蛋白表达的影响。2、加入STAT1特异性抑制剂氟达拉滨(fludarabine),检测IL-35对OC分化相关信号通路的影响,进一步探讨IL-35影响OC分化和功能的相关机制。3、采用DBA/1J小鼠诱导建立CIA模型,实验组与模型组分别给予IL-35和磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)腹腔注射,评估小鼠一般状态及关节炎情况,并对关节骨组织行TRAP染色、苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色和微计算机断层扫描(Micro computed tomography,Micro-CT),评估IL-35在CIA小鼠模型骨破坏中的作用。结果:1、CCK-8结果显示IL-35对RAW264.7细胞无明显促进或抑制增殖的作用,说明IL-35对RAW264.7细胞活性无明显的影响。TRAP染色结果提示,RAW264.7细胞可以在RANKL和M-CSF诱导下分化成为成熟OC,不同浓度的IL-35组与对照组(即IL-35为0ng/ml组)相比,IL-35呈现浓度依赖的抑制OC生成(P<0.05),在200ng/ml组几乎无TRAP阳性细胞生成。Transwell小室结果显示,IL-35可以减少OC迁移和侵袭的穿膜细胞数,说明IL-35可以抑制OC的迁移、侵袭能力。RT-PCR及Western blot结果提示,IL-35显著降低C-fos、活化T细胞核因子1蛋白(NFATc1)及OC标志性因子核因子κB受体活化因子(Receptor Activator of Nuclear factorκB,RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRACP)、组织蛋白酶K(cathepsin K)的表达水平(P<0.05)。2、TRAP染色结果显示,加入fludarabine组TRAP阳性细胞数较IL-35组增多(P<0.05),但少于对照组。RT-PCR和Western-blot结果提示,IL-35可以促进STAT1的磷酸化,同时能够抑制PI3K/AKT信号通路及下游转录因子C-fos和NFATc1的表达,而这种抑制作用会被fludarabine所减弱(P<0.05)。3、与对照组相比,CIA+IL-35组和CIA组小鼠体重均呈现下降趋势,且CIA组体重整体低于CIA+IL-35组;CIA组关节肿胀度、关节炎指数明显高于CIA+IL-35组。关节骨组织TRAP染色提示IL-35可明显减少关节滑膜及骨组织附近TRAP阳性细胞数量。HE染色提示IL-35显著减轻滑膜增生及炎性细胞的浸润、聚集以及骨组织的破坏。Micro-CT提示IL-35上调CIA小鼠的骨体积分数(BV/TV)、骨密度(BMD)并减少CIA小鼠的关节骨破坏。结论:1、IL-35对RAW264.7细胞系无明显细胞毒性;IL-35能够抑制OC分化、减少成熟OC的生成,抑制OC的迁移和侵袭能力;同时还可以降低OC中RANK、TRACP、Cathepsin K、C-fos及NFATc1的基因及蛋白表达。2、IL-35通过激活STAT1通路、抑制PI3K/AKT信号通路及下游转录因子的表达,抑制RANKL和M-CSF诱导的OC分化。3、IL-35可以减轻胶原诱导性关节炎小鼠模型的关节骨破坏程度,起到骨保护作用。

摘要译文

关键词：

类风湿关节炎; 骨破坏; 白细胞介素-35; 破骨细胞

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

内科学

导师：

鲁静

中图分类号：

R593.22[类风湿性关节炎⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27652/d.cnki.gzyku.2022.000152