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基于唾液酸结构多价糖缀合物的合成与抗流感活性研究认领

被引量： 1

作者：

于耀

学位授予单位：

天津科技大学

摘要：

流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,其多次在世界范围内的爆发流行,均对人类生命健康及社会经济造成严重危害及影响。流感病毒表面大量分布着两种重要的唾液酸结合蛋白:血凝素（Hemagglutinin,HA）与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）。HA通过结合宿主细胞表面寡糖链末端唾液酸残基介导病毒感染前期与宿主的识别、粘附。NA能够水解糖链末端的唾液酸糖苷键,使子代病毒顺利释放,阻止子代病毒聚集。同时NA也具有裂解呼吸道粘膜表面唾液酸,加快病毒在呼吸道内的传播的作用。相比于HA的较易突变特性,NA的活性中心有一段序列高度保守的11个氨基酸,因此目前广泛使用的临床一线药物是以奥司他韦、扎那米韦及拉尼米韦等为代表的一系列NA抑制剂。此类药物在结构上是模拟NA水解唾液酸中间体过渡态,通过占据NA活性位点,竞争性抑制NA与唾液酸底物相结合,达到抑制流感病毒增殖的目的。但是,随着流感病毒不断变异,以奥司他韦为代表的上市药物逐渐出现了病毒耐药株,因此寻找结构新颖的新型流感病毒抑制剂迫在眉睫。本课题以流感病毒表面NA和HA的天然配体唾液酸结构为研究对象,结合上市药物的成功案例,在对药物活性位点、作用机制、构效关系进行综合分析的基础上,设计并通过20步化学反应合成了以氨基和胍基修饰唾液酸C-4位;C-2位引入硫原子用于抵抗NA对唾液酸糖苷键的水解作用,且末端修饰含叠氮的连接臂便于为后续多价修饰提供反应位点;氟原子修饰C-3位用于提高与NA活性位点亲和力的唾液酸衍生物,希望得到高效的NA抑制剂。在此基础上,依据“糖簇效应”原理,依次选用人血清白蛋白及多聚甲基乙烯基醚马来酸酐共聚物作为骨架,通过无铜催化Click反应及酸酐氨解反应制备了新型多价蛋白缀合物及高分子马来酸酐聚合物。建立了核磁共振氢谱、基质辅助激光解析飞行时间质谱、分子排阻色谱等方法表征缀合物及高聚物表面偶联的寡糖数目及分子量的方法,后续的定量活性评价奠定了基础。使用神经氨酸酶抑制实验、细胞生长抑制实验、细胞病变实验在病毒及细胞水平全面评价了所合成化合物的抗流感活性。结果表明,C-4位胍基修饰及C-3位氟代均能够提高单体唾液酸的抗流感活性,并且多价修饰对活性的提升更加显著,体现在多价蛋白缀合物细胞水平活性较单体唾液酸衍生物提高45倍,高聚物神经氨酸酶抑制活性优于临床抗流感用药扎那米韦。更进一步的SPR实验、血凝抑制实验、动态光散射实验、病毒捕获实验表明多价蛋白缀合物及高聚物主要通过三重机制抑制流感病毒的复制与增殖:即与病毒表面的HA结合、干扰病毒与宿主的粘附;与NA结合,干扰子代病毒的释放;通过与HA和NA的结合作用,使病毒粒子聚集,干扰病毒前期粘附、内吞与后期释放。与此同时,借助糖簇效应,上述的多价蛋白缀合物及高聚物对于H274Y的耐奥司他韦突变NA蛋白的结合力也得到了明显的提高,其NA抑制活性IC50和蛋白结合常数KD均达到了亚微摩尔水平。上述结果为今后基于多价唾液酸衍生物的抗流感药物设计奠定了理论和实验基础。在综合以上C-3位单氟取代结构的基础上,又进一步合成了C-2、C-3位双氟取代的唾液酸衍生物。神经氨酸酶抑制实验表明,C-3位平伏键取代的氟原子,与NA具有更高的亲和力,并能够进一步提高唾液酸衍生物的NA抑制活性,其抑制活性较直立键氟原子取代衍生物有显著提高。基于此结果,又设计了C-3位氟原子取代,C-1位磷酸取代的唾液酸衍生物,并完成了关键中间体的合成。上述工作为基于唾液酸的神经氨酸酶抑制剂的设计提供了新的思路,丰富了唾液酸的改造策略,加深了唾液酸-神经氨酸酶结合的构效关系的认识,为今后设计并开发新型流感病毒抑制剂奠定了基础,扩展了制糖工程的学科外涵和内延。

摘要译文

关键词：

流感; 抑制剂; 神经氨酸酶; 血凝素; 唾液酸; 多价

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

轻工技术与工程

导师：

杨杨

中图分类号：

R914[药物化学];R96[药理学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100701[药物化学];100705[微生物与生物技术药物学];100109[医学药理学];100706[药理学]

D O I：

10.27359/d.cnki.gtqgu.2021.000313