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白木香转录因子WRKY44降解机制及其互作蛋白生物功能研究认领

被引量： 2

作者：

余翠翠

学位授予单位：

北京协和医学院

摘要：

沉香来源于瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)植株含树脂的木材。具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等药效作用,使用历史悠久,《名医别录》中将沉香列为上品。中国产沉香唯一法定来源树种为白木香,白木香树是典型的伤害诱导型药用植物。健康白木香树不能结香,需要经过凿洞、打钉、接菌、火烙、砍伤等不同伤害后才能产生树脂沉香。倍半萜为沉香中的主要活性化学成分之一,倍半萜合酶为沉香倍半萜合成途径中最关键的催化酶。前期我们实验室筛选到沉香中一个重要倍半萜合酶基因ASS1,并找到了调控ASS1表达的关键转录因子WRKY44,它是位于ASS1启动子上游W-box处的转录抑制子,类似一个“开关”。健康状态下抑制ASS1转录表达;当植物受到伤害后,WRKY44通过某种机制被降解,ASS1开始转录表达,合成倍半萜。但WRKY44是如何降解的,尚不清楚。阐述清楚WRKY44的降解分子机制是解析白木香受伤害诱导后形成沉香机理的关键点之一。基于此,本论文围绕转录因子WRKY44受伤害后的降解机制,以WRKY44为研究对象,采用免疫沉淀与质谱联用(IP-MS)方法鉴定与WRKY44降解相关的互作蛋白,解析了 WRKY44的降解分子机制,并对与WRKY44互作的蛋白的功能进行了研究。研究旨在解析白木香伤害诱导发生防御反应形成沉香的关键调控机制,并筛选出调控沉香结香的关键蛋白。主要研究成果如下:(1)筛选到3类与WRKY44降解相关的蛋白。通过IP-MS实验筛选与WRKY44的互作蛋白,基于蛋白降解性质,主要关注于筛选结果中3类与WRKY44降解相关蛋白:泛素化修饰相关类蛋白、蛋白激酶、伴侣蛋白。成功克隆其中7个关键基因(AsSnRK1y,AsCDPK,AsHECT,AsRING1,AsRING2,AsRING3,AsHSP70),为后续蛋白生物功能研究奠定基础。(2)明确WRKY44通过泛素-蛋白酶体途径降解,并筛选到能直接调控WRKY44泛素化修饰的RING型E3泛素连接酶RING3。WRKY44体内降解实验表明,MeJA处理愈伤组织后,WRKY44和泛素化修饰的WRKY44蛋白迅速降解,26S蛋白酶抑制剂MG132可以有效延缓WRKY44蛋白的降解速度。随后的IP实验结果与WRKY44体内降解实验结果一致。结合酵母双杂交、pull-down和BIFC实验,证实C3HC4型E3连接酶RING3与WRKY44在体内外直接互作。随后体外泛素化实验表明RING3具有E3泛素连接酶活性,且能够对WRKY44进行体外泛素化修饰。获得RING3-RNAi白木香转基因愈伤,体外降解实验表明WRKY44蛋白在转基因愈伤中降解速度相比于对照组明显减慢,表明RING3直接调控WRKY44蛋白通过泛素-蛋白酶体途径被降解。(3)GC-MS检测表明RING3能够调控白木香中倍半萜含量。GC-MS检测RING3-RNAi转基因愈伤中倍半萜含量,结果表明转基因愈伤中检测到4种倍半萜成分(α-guaiene,humulene,aromadendrene 和 δ-guaiene),且倍半萜合酶ASS1的主要催化产物α-guaiene,humulene和δ-guaiene在转基因愈伤中含量显著高于对照组,说明RING3/WRKY44/ASS1模块在调控白木香受伤害后倍半萜含量的产生过程中发挥了重要作用。(4)筛选到WRKY44互作蛋白AsSnRK1γ,明确AsSnRK1γ能调控白木香淀粉合成途径,调控白木香倍半萜含量。通过IP-MS实验,结合酵母双杂交、pull-down和BIFC实验证实WRKY44与AsSnRK1γ在体内外直接互作。转基因实验表明,过表达AsSnRK1γ转基因愈伤中淀粉和葡萄糖含量均高于对照组,且淀粉合成途径中关键酶基因:AGPase,GBSS,NI,SBE1,SBEII,SPP,SSP I,SSI和SS基因表达量在转基因愈伤中均比对照组中高。GC-MS检测结果表明转基因愈伤中共检测到的4种倍半萜(α-guaiene,humulene,aromadendrene,δ-guaiene)中的两种倍半萜成分(α-guaiene,δ-guaiene)含量显著高于对照组。(5)对IP-MS筛选到的AsHSP70基因进行基因家族鉴定,生信分析,表达分析和亚细胞定位,为后续深入研究其生物功能奠定基础。共筛选到15条AsHSP70基因,分成6个亚族。15条AsHSP70基因在热胁迫处理后表达水平均升高。各基因在沉香层、枝、根、茎、老叶、嫩叶、芽和花中均有表达,其中AsHSP70-1,AsHSP70-11,AsHSP70-3,AsHSP70-5和AsHSP70-15在沉香层中表达量高。通体结香技术处理植株后,15条基因在沉香形成过程中的不同时间或不同形成层中能够显著表达,部分基因主要在沉香层中表达,表明他们可能在沉香形成过程中起关键作用。综合以上结果,本研究不仅揭示了 MeJA处理下RING型E3泛素连接酶RING3介导转录因子WRKY4降解的分子机制,解析了倍半萜合酶ASS1健康条件下不表达,受伤害后启动表达的关键分子调控网络,且首次克隆了在WRKY44降解过程中活跃蛋白AsSnRK1γ,AsHSP70基因,初步探究其在促进倍半萜合成及沉香形成中的生物功能,为揭开沉香形成机理提供了一个新的视角。本研究解析清楚了伤害诱导白木香形成沉香分子机制的关键节点,为深刻认识结香机制及高效结香技术的创新发明提供了关键数据。

摘要译文

关键词：

白木香; 倍半萜; 沉香; WRKY44; RING3; 泛素-蛋白酶体途径; AsSnRK1γ; AsHSP70

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

生药学

导师：

魏建和

中图分类号：

S567.1[木本⑨]

学科分类号：

0901[作物学];100810[分子生药学]

D O I：

10.27648/d.cnki.gzxhu.2022.000707