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基于靶标结构与表型筛选的新型抗流感病毒先导化合物的发现认领

被引量： 1

作者：

鞠翰

学位授予单位：

山东大学

摘要：

由流感病毒感染引起的流感每年可导致约50万人死亡,而近年来动物源性流感病毒特别是禽流感病毒跨越物种屏障感染人类的病例不断出现,更是加大了流感防控的难度。此外,流感可与新冠共存,两者合并感染的重症及死亡风险大增。因此,流感的防治依然是当前及未来医药卫生领域重点关注的课题。尽管目前已有多种抗流感药物获批上市,但是它们的广泛临床应用却面临着诸多限制,其中最严重的是耐药性问题。由于流感病毒固有的高变异性,具有耐药属性的突变毒株会在药物进入临床使用后快速出现并严重削弱药物的疗效,例如对金刚烷胺耐药的M2-S31N突变毒株、对奥司他韦耐药的NA-H274Y突变毒株和对巴洛沙韦耐药的PA-I38T突变毒株。因此,优化、改进现有药物和研发高效、抗耐药的新型药物对流感的防治具有十分重要的现实意义。流感病毒是一种RNA病毒,可以编码至少12种功能蛋白,这些蛋白发挥各自的生物调节功能维持着流感病毒生命周期的有序进行,而通过抑制这些蛋白的生物学功能来阻断病毒生命周期的正常进行是小分子抗流感药物研发的基础。基于此,本论文分别针对流感病毒神经氨酸酶的新结合位点150-腔和新颖靶标聚合酶PA-PB1相互作用进行基于靶标结构的药物设计,最终得到了 3类共计71个目标化合物,并对它们进行了抗流感病毒活性评价和初步成药性评价。此外,本论文还运用基于细胞的表型筛选技术对实验室自有(in-house)化合物库中近百个具有抗流感优势结构的小分子进行了活性筛选和作用机制探讨。1.靶向神经氨酸酶150-腔的抗流感病毒候选药物的发现NA(Neuraminidase)在流感病毒复制的末期发挥着关键作用。本部分基于NA-奥司他韦晶体复合物结构解析及课题组前期获得的构效关系,以奥司他韦的C-5位氨基为修饰位点,对Group-1 NA中新发现的150-腔的内部亚结构区域进行了系统的探索。首先,运用多位点结合策略和骨架跃迁策略对课题组前期发现的14和16的侧链进行了靶向于150-腔开口区域或/和底部区域的修饰,得到了21个含稠环结构的目标化合物;随后通过分析150-腔内部的空间结构及其与奥司他韦C-5位侧链的位置关系,运用多样性取代修饰策略围绕着化合物14的侧链进行了精细的结构修饰,最终得到了 29个含有联苯结构的奥司他韦衍生物。生物活性评价显示,第一类化合物中的ⅠD-3d和第二类化合物中的ⅡB-4b和ⅡB-4e表现出极强的NA抑制活性和抗流感病毒活性。ⅠD-3d(IC50=0.27-0.73 nM)对H1N1-NA、H5N1-NA和H5N8-NA的抑酶活性较奥司他韦的活性形式OSC提高了 14-53 倍,ⅡB-4b(IC50=0.12-0.91 nM)和 ⅡB-4e(IC50=0.50-1.33 nM)对这三种亚型NA的抑酶活性较OSC分别提高了 38-86倍和10-69倍。ⅡB-4b和ⅡB-4e还能够强烈抑制最常见的两种奥司他韦耐药突变H274Y-NA,ⅡB-4b对它们的抑酶活性较OSC分别提高了 34倍和39倍,ⅡB-4e对这两个耐药突变亚型的抑酶活性较OSC也分别提高了 8倍和51倍。此外,化合物ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e在细胞水平对人流感H1N1毒株和禽流感H5N1、H5N8毒株的抑制活性也明显超越了阳性药物OSC,且CC50值大于250 μM。成药性评价显示:这三个化合物具有良好的人肝微粒体代谢稳定性和较低的CYP酶抑制活性;大鼠体内药代动力学研究显示ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e的口服生物利用度分别为13.7%、11.8%和3.9%,优于或与OSC相当;安全性评价显示,小鼠对这三个化合物的耐受性良好,LD50均大于1000mg/kg。在动物感染模型中ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e同样展现出强大的抗流感病毒效力,极大地提高了实验动物的生存率。总之,ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e是极具临床应用前景的NA抑制剂,可作为抗流感候选药物供进一步开发。2.以聚合酶PA-PB1相互作用为靶标的小分子抑制剂的发现RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)是由PA、PB1和PB2亚基组成的异源三聚体,干扰这三个亚基之间的相互作用可以有效破坏RdRp的活性,抑制病毒的增殖。与传统的以RdRp中单体亚基PA、PB1或PB2为靶标的药物发现策略不同,本研究聚焦于蛋白-蛋白相互作用这一药物靶标新理念,开展了以PA-PB1相互作用为靶标的药物设计。通过文献调研,我们选取与PA-PB1作用界面结合能力最强的2-氨基-3-甲酰胺基-环庚烷并噻吩片段(cHTC)为核心结构,在其3位甲酰胺基侧链引入已发现的适配性最强的2-吡啶基团,同时对其2位氨基侧链进行改造,以期在最大程度上占据蛋白-蛋白相互作用的疏水性界面并满足相应药效团模型的要求,由此得到了 2 1个结构新颖的cHTC衍生物。靶标活性测试显示,该系列中13个化合物对PA-PB1相互作用表现出抑制作用,其中活性最好的化合物Ⅲ-6a和Ⅲ-6q的IC50值分别为75μM和85μM。化合物Ⅲ-6a和Ⅲ-6q还展现出广谱的抗流感病毒活性(EC50=14.6-69.8μM),虽然它们的活性与OSC还存在一定差距,但已接近同类型抑制剂(含有cHTC结构)中活性最强化合物40的水平。此外,该类化合物的细胞毒性极低,且在鸡胚模型中展现出了明确的抗流感病毒活性。总之,本研究为研发新型、广谱的抗流感药物提供了新的可能性。3.基于表型筛选的新型抗流感先导化合物的发现表型筛选是快速发现具有特定药理活性的新型小分子的有效途径,而基于细胞表型分析的药物筛选由于其高效、便捷、直观等特点更是受到了广泛的关注。本部分研究对in-house化合物库中极具抗流感病毒潜力的二芳基嘧啶(DAPY)衍生物和查尔酮衍生物进行了抗流感表型筛选,最终发现了具有良好的、广谱的抗流感病毒活性的DAPY衍生物A4和查尔酮衍生物B23。作用机制研究显示,A4可以通过促进NP的非功能性聚集和阻断NP的核输入过程来抑制病毒的复制,而B23则可以通过抑制NP的核输出过程来发挥抗流感病毒作用。初步成药性评价显示A4和B23具有良好的人血浆稳定性,对主要CYP酶无明显抑制作用,且在1000 mg/kg剂量下对小鼠无急性毒性。总之,鉴于A4和B23良好的抗流感病毒活性和成药潜力,以及与上市药物完全不同的结构骨架和新颖作用机制,可以作为新型抗流感先导化合物供后续研究。综上所述,本论文以发现新型、高效、抗耐药的抗流感先导化合物及候选药物为目的,从基于经典靶标NA全新结合位点150-腔的药物设计和基于新颖靶标PA-PB1相互作用的药物设计出发,综合运用骨架跃迁、多样性取代修饰等药物化学策略,设计并合成了 3类共计71个目标化合物,经过靶标活性、细胞活性和成药性评价,最终发现了 3个(ⅠD-3d、ⅡB-4b和ⅡB-4e)兼具极强抗流感病毒能力和良好成药性的NA抑制剂。此外,通过基于细胞的表型筛选技术发现了具有较强抗流感病毒活性的DAPY衍生物A4和查尔酮衍生物B23,作用机制研究显示它们可以通过抑制流感病毒NP的核转运过程来抑制病毒增殖。总之,本论文研究不仅发现了极具临床应用价值的抗流感候选药物,还发现了具有新骨架和新机制的抗流感先导化合物,为抗流感药物的研发奠定了坚实的物质基础并为新靶标新机制的药物研发提供了新的线索和方向。

摘要译文

关键词：

流感病毒; 神经氨酸酶; PA-PB1相互作用; 表型筛选; 候选药物; 先导化合物

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

药物化学

导师：

刘新泳

中图分类号：

R914[药物化学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100701[药物化学];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2022.000218