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近红外二区荧光染料标记黑色素纳米探针的构建及其应用研究认领

被引量： 5

作者：

蔡雯雯

学位授予单位：

山西医科大学

摘要：

目的:NIR-Ⅱ FI（1000-1700 nm）能够提供更深的组织穿透能力（?10 mm）,更高的信噪比和更好的时空分辨率。光声成像是近年来一种新兴的无创成像手段,整合了传统光学成像卓越对比度和超声成像高时空分辨率的优势。NIR-Ⅱ FI和PAI相结合为开发用于临床疾病成像、靶向治疗、疗效评估以及预后监测等的多模态探针提供了新策略。黑色素是一种广泛存在于人体的内源性色素,具有生物相容性好、可降解、化学结构易于修饰、光保护作用、金属离子螯和能力以及抗氧化等特性,因此广泛应用于包括生物成像、光热治疗、生物传感、诊疗一体化、抗感染和组织工程等生物医学领域中。本研究的目的是利用NIR-Ⅱ小分子荧光染料对人体内源性黑色素纳米颗粒（MNPs）进行标记,构建一种新型生物相容性好,且集NIR-Ⅱ荧光成像、光声成像和光热治疗于一体的多功能纳米探针MNPH2,首先对该纳米探针的基本表征和性能进行研究,随后探索其作为一种双模态造影剂及诊疗一体化制剂在干细胞示踪与肿瘤诊疗中的应用。方法:1.NIR-Ⅱ小分子荧光染料H2标记仿生黑色素纳米颗粒,构建多功能纳米探针MNPH2,并对其基本表征和性能进行研究。1.1利用仿生MNPs与NIR-Ⅱ荧光小分子染料H2化学反应获得MNPH2多功能纳米探针。1.2对MNPH2的TEM、FT-IR、稳定性、DLS、Zeta电位以及UV-Vis-NIR光吸收波谱等基本表征进行研究。1.3研究MNPH2的体外NIR-Ⅱ荧光成像、PA成像和光热转化性能。1.4通过体外溶血实验和大剂量活体注射对MNPH2的生物安全性进行评估。2.MNPH2标记hUMSCs后活体内长期NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪并实现治疗急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM、NIR-Ⅱ荧光显微镜和FCM分析hUMSCs对MNPH2的摄取能力（即MNPH2体外标记hUMSCs的能力）。2.2 CCK-8实验分析MNPH2对hUMSCs增殖活性的影响,成骨、成脂诱导分化实验分析MNPH2对hUMSCs分化能力的影响。2.3对MNPH2标记的hUMSCs行体外NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。2.4 MNPH2标记的hUMSCs经皮下注射移植入活体后长期行NIR-Ⅱ FI/PAI双模态示踪观察。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后行可视化治疗和疗效评估。3.MNPH2对喉癌行NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导光热治疗的诊疗一体化研究。3.1 CCK-8实验评估MNPH2对Hep-2细胞的增殖活性影响,NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM观察Hep-2细胞对MNPH2的摄取能力,Calcein-AM/PI活死细胞双染分析MNPH2对Hep-2细胞的光热毒性。3.2构建喉癌活体肿瘤模型,并对其进行活体NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像。3.3评估荷喉癌裸鼠在NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导下肿瘤光热治疗的效果。结果:1.通过简单的一步法合成了具有良好生物相容性、NIR-Ⅱ FI和PAI以及光热转化性能的多功能纳米探针MNPH2。1.1 H2末端具有-COOH,在EDC/NHS的催化作用下与MNP-PEG末端的-NH2发生脱水缩合,形成酰胺键后连接起来,且每个MNP-PEG分子能够结合22个H2分子。1.2 MNPH2具有良好的水溶性和生理稳定性;TEM图像中MNPH2颗粒呈类圆形,大小一致,分布比较均匀;MNPH2的FT-IR光谱图中有酰胺键的吸收峰存在,证明了MNP-PEG与H2成功连接;MNPH2的水合粒径为33 nm,zeta电位为-13.3m V;UV-Vis-NIR吸收光谱显示MNPH2在近红外区有特征吸收峰,波峰位置处于768 nm。1.3 MNPH2具有良好的NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能,且荧光信号和光声信号均随溶液浓度的增高逐渐增强,两者具有良好的相关性;MNPH2还显示出优良的光热转化效率和光热稳定性。1.4溶血实验结果表明MNPH2不会引发红细胞破碎导致溶血;大剂量MNPH2注射入小鼠活体后无明显的肝肾功能异常发生,且主要脏器的HE染色无异常病理学改变。2.MNPH2作为NIR-Ⅱ FI和PAI探针,实现活体内对hUMSCs的长期双模态示踪,以及hUMSCs治疗小鼠急性肝损伤过程的可视化和疗效评估。2.1 CLSM和NIR-Ⅱ荧光显微镜结果证明hUMSCs能通过简单的共培养方式将MNPH2颗粒摄取入细胞质内;FCM定量分析结果表明共培养4小时后,hUMSCs对MNPH2的摄取能力高达98.57%。2.2 CCK-8结果表明当MNPH2的浓度低于800μg/m L时,不会影响hUMSCs的增殖活性;成骨、成脂诱导分化实验证明hUMSCs经MNPH2标记后并不会影响其分化潜能。2.3 MNPH2成功标记hUMSCs后能够实现细胞在体外的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像,且细胞数量越多,信号越强。2.4 MNPH2体外标记的hUMSCs经皮下注射移植入小鼠活体后,移植部位会发出NIR-Ⅱ荧光和PA信号,且信号随时间延长而逐渐减弱,至示踪第21天基本消失。2.5 MNPH2标记的hUMSCs经静脉注射移植入急性肝损伤小鼠后,NIR-Ⅱ FI和PAI都表明绝大多数细胞定植于损伤的肝脏组织内,并于注射后6小时细胞数量最多;NIR-Ⅱ FI也表明部分hUMSCs可经由肝-肠轴代谢排出体外。治疗过程中小鼠体重、血清学和组织病理学指标均表明hUMSCs能对小鼠急性肝损伤疾病发挥良好的治疗效果,且非瞬时作用。3.MNPH2作为诊疗一体化制剂用于活体喉癌的NIR-Ⅱ荧光和PA双模态成像引导的光热治疗。3.1 CCK-8结果表明MNPH2不会对Hep-2细胞的增殖活性产生影响;但若加以激光照射,MNPH2会释放热能杀伤细胞,导致细胞活性大幅度下降,且MNPH2孵育浓度越高,细胞活性越低;NIR-Ⅱ荧光显微镜和CLSM荧光图片表明Hep-2与MNPH2共孵育后会发生摄取;Calcein-AM/PI活死细胞双染从细胞层面再次证实MNPH2通过光热转化效应产生的热量足以杀死Hep-2细胞。3.2喉癌活体NIR-Ⅱ FI和PAI表明MNPH2经尾静脉注射后肿瘤被逐渐“点亮”,肿瘤组织的NIR-Ⅱ荧光和PA信号随时间延长而逐渐增强,于注射后8小时达到峰值,随后逐渐减弱。荷瘤小鼠主要脏器和肿瘤组织的NIR-Ⅱ FI图像表明MNPH2主要通过肝肠代谢排出体外。3.3在NIR-Ⅱ FI和PAI引导下对喉癌进行近红外激光照射,肿瘤局部温度升高至59.2℃,达到了杀伤肿瘤细胞的效果;对荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积及肿瘤组织的HE染色分析表明MNPH2具有良好的光热治疗肿瘤的效果,且无副作用产生。结论:本研究以仿生型黑色素纳米颗粒为基础,通过一步法合成了集NIR-Ⅱ FI和PAI以及PTT治疗为一体的多功能纳米探针MNPH2。该探针具有以下优势:1)良好的水溶性和生理稳定性;2)优异的近红外光吸收特性;3)良好的生物安全性;4)NIR-Ⅱ荧光和PA成像性能;5)较高的光热转化效率和光热稳定性。该纳米探针实现了长期活体示踪皮下移植hUMSCs和治疗小鼠急性肝损伤的可视化,同时还能够实时无创动态监测活体肿瘤,在NIR-Ⅱ FI和PA双模态成像的引导下进行喉癌光热治疗。总之,MNPH2既可用于干细胞示踪和再生医学,又能用于肿瘤的诊疗一体化。本项研究进一步推动了以黑色素为核心的多功能纳米探针在生物医学领域应用的节奏,为其潜在的临床转化做准备。

摘要译文

关键词：

NIR-Ⅱ荧光染料; 黑色素; NIR-Ⅱ荧光/PA双模态成像; 干细胞示踪; 肿瘤诊疗一体化

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

影像医学与核医学

导师：

张瑞平

中图分类号：

R943[制剂学]

学科分类号：

083611[医药生物工程];100603[中西医结合药学];100702[药剂学]

D O I：

10.27288/d.cnki.gsxyu.2021.000010