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紫苏叶中降血糖活性成分的筛选分离及其作用机制认领

被引量： 15

作者：

王振兴

学位授予单位：

江西师范大学

摘要：

紫苏是我国传统药食两用植物,其常用部位为叶子。紫苏叶的风味独特、富含营养成分,含有丰富的生物活性成分如酚类、黄酮类、花青素、单宁和精油等,具有抗氧化、抗过敏、抗炎、抗肿瘤和抗菌等多种活性,在食品、医药、化工等领域均有广泛应用。已有许多文献报道紫苏叶中的各种活性成分具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,说明紫苏是降血糖药物的潜在来源。但目前关于其在糖尿病防治方面的研究较少,其降血糖作用的具体成分和作用机制尚不明确。因此,本论文以紫苏叶为原料,采用体外模拟消化模型和糖尿病大小鼠模型评估了紫苏叶的降血糖活性,分析其对糖尿病小鼠肠道微生物的影响和降血糖机制,并分离鉴定了其主要化合物,最后探讨了利用益生菌发酵对其功能活性增效的方法。主要研究内容如下:建立了体外模拟消化模型,评估了紫苏叶提取物（PFLE）经消化后的化学成分和功能活性。结果表明,经模拟胃肠消化后,紫苏叶提取物中的总酚含量降低了53%,总黄酮含量降低了40%,其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基能力的IC50值分别上升了23%和56%,铁还原抗氧化能力则降低了53%。α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶抑制能力和对MCF-7细胞增殖的抑制能力的IC50值分别提高了360%、197%和25%。采用高效液相色谱法从PFLE中鉴定并定量三种酚酸和一种黄酮,分别为（+）-儿茶素、丁香酸、迷迭香酸和绿原酸,经模拟消化后含量均明显降低。总的来说,紫苏叶提取物经过体外胃肠消化后活性成分和生物活性显著降低,但仍然具有一定的抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制能力、乙酰胆碱酯酶抑制能力和MCF-7细胞增殖抑制能力,显示出作为治疗和预防氧化应激、癌症、糖尿病和阿尔茨海默病的潜力,可对紫苏叶中的活性成分和功能进行进一步研究。采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等不同极性溶剂对PFLE进一步萃取,得到了不同极性的萃取组分,评估了所萃取组分的抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶抑制能力和抗癌能力,以评价其防治氧化应激相关疾病的能力;采用高效液相色谱法（HPLC）对生物活性最好的组分进行定量分析,并建立糖尿病大鼠模型进一步评价其抗糖尿病作用。结果表明,紫苏叶提取物乙酸乙酯相萃取组分（PFLEEA）的总酚含量和总黄酮含量较高,分别为440.48μg GAE/mg DE和455.22μg RE/mg DE,抗氧化活性最强,其DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子清除能力和铁还原能力分别是对照Vc的1.71、1.14、2.40和1.29倍。PFLEEA的α-葡糖苷酶抑制活性最强,比对照阿卡波糖高2倍。相比其它萃取相,PFLEEA具有最高的乙酰胆碱酯酶抑制能力和对MCF-7、Hep G2细胞增殖的抑制能力。从乙酸乙酯相萃取组分中检测到5种酚酸和9种黄酮,其中木犀草素、迷迭香酸、芦丁和儿茶素是主要成分。动物实验结果表明,PFLEEA可显著降低糖尿病大鼠的血糖水平、进食量和进水量,并增加其体重,调节其血清的总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平,改善糖尿病导致的肝肠组织病理生理状况,并增加肝和肠中糖原的积累。建立了C57BL/6糖尿病小鼠模型,研究了PFLEEA对小鼠肠道微生物群落的影响,并采用转录组（RNA-seq）技术对糖尿病小鼠在基因水平的变化进行了分析。发现经PFLEEA治疗后,糖尿病小鼠的血糖明显降低、血脂指标有显著改善。PFLEEA降低了糖尿病小鼠的微生物总丰度,改变了肠道微生物菌落的组成结构,如降低了芽孢杆菌（Bacillus）等细菌相对丰度,显著提高了梭菌（Clostridiales）、阿克曼菌（Akkermansia）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）等有益菌的丰度,提高了拟杆菌（Bacteroidaceae）、乳酸细菌（lactobacillaceae）等与短链脂肪酸产生有关的细菌的丰度。转录组学分析表明,PFLEEA共性上调了2个与防治糖尿病有关的基因Zfp422和Ipmk,下调了6个基因,其中Saa2、Atf3与Gadd45α与胰岛素抵抗或糖尿病发病有关,GO富集结果表明,基因变化主要集中在生物过程方面,并通过KEGG富集了27个可能的信号通路,其中Fox O signaling pathway是最有可能的信号通路。通过柱层析、Sephadex LH-20等色谱分离手段,从PFLEEA中分离鉴定出18个化合物,其中有3个酚酸化合物,分别是没食子酸甲酯、迷迭香酸甲酯和对羟基肉桂酸（反式桂皮酸）;7个黄酮类化合物,分别是黄芩素-7-O-葡萄糖苷、木樨草素、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸甲酯、野黄芩苷（灯盏花乙素）、5,7-二甲氧基-6-甲基-4’-甲基-二氢黄酮等;三萜类化合物3个,分别是熊果酸、山楂酸、齐墩果酸;以及5个有机酸、脂肪酸等其他化合物。另外采用高分辨质谱对PFLEEA进行了鉴定,从中鉴定了32个化合物,其中酚酸类化合物13个、黄酮类化合物5个、萜类4个、有机酸2个。这些化合物可能是紫苏叶发挥降血糖作用的物质基础。为进一步改善紫苏叶中有效成分和功能活性,采用6种益生菌对紫苏叶进行发酵,发现短期发酵（1-3天）可以显著提高紫苏叶中的活性成分含量,提高其抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制能力等功能活性,但是长期发酵则显著降低了其化学成分含量和功能活性。其中,嗜热链球菌CICC 6038、干酪乳杆菌ATCC 334可显著提高紫苏叶的总酚含量,植物乳杆菌ATCC 8014、鼠李糖乳杆菌ATCC 53013、嗜热链球菌CICC 6038可以显著提高紫苏叶的总黄酮含量。鼠李糖乳杆菌ATCC53013和嗜热链球菌CICC 6038可大幅提高紫苏叶的DPPH、ABTS自由基清除能力,嗜热链球菌CICC 6038和植物乳杆菌ATCC 8014可提高其铁还原能力。鼠李糖乳杆菌ATCC 53013能明显的提高其α-葡萄糖苷酶抑制能力和乙酰胆碱酯酶抑制能力。进一步采用HPLC对其化合物含量的变化进行定量追踪,发现紫苏叶中的化合物在发酵过程中发生了降解和转化。因此,益生菌发酵是一种可改善紫苏叶中有效成分和功能活性的有效手段。以上结果可以为紫苏防治糖尿病和进一步利用开发提供理论依据。

摘要译文

关键词：

紫苏叶; 分离纯化; 降血糖; 肠道微生物; 转录组; 发酵

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

有机化学

导师：

涂宗财俞初一

中图分类号：

R284.2[有效成分的分离与提取]

学科分类号：

1005[中医学];100801[中药资源学];100804[中药化学]

D O I：

10.27178/d.cnki.gjxsu.2021.000271