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吻侧岛叶及其相关神经通路参与痛觉信息传递和调控的机制研究认领

作者：

白杨

学位授予单位：

中国人民解放军空军军医大学

摘要：

慢性痛是一种常见的临床疾病,迁延不愈的疼痛会导致包括焦虑在内的多种情绪障碍,两者交互恶化进一步加重疼痛,给患者带来巨大的身心负担。尽管人们已开始关注疼痛的情绪维度,但是对大脑内痛觉情绪相关的高级中枢仍缺乏深入了解。岛叶（IC）是边缘系统的重要组成部分,是个体实现从外界刺激到内在自我情绪认知的重要节点。近年来,岛叶在痛觉传递和调控中的作用日益受到关注。基于解剖联系特征,一般认为吻侧岛叶（aIC）与痛觉的情感方面有关,而尾侧岛叶（p IC）与痛觉的感觉方面相关,但目前仍缺乏明确的行为学证据。作为内侧痛觉系统的重要组成部分,丘脑背内侧核（MD）主要投射到与情感性痛觉调制相关的皮层脑区,如内侧前额叶皮质（m PFC）、前扣带回（ACC）和aIC。其中MD-ACC神经通路已被阐明参与了痛觉相关厌恶情绪的产生,那么MD-aIC神经通路是否也参与了情感性痛觉信息的传递和调控呢?既往关于岛叶在慢性痛领域的基础研究多基于神经病理性痛模型,神经损伤引起岛叶兴奋性增强的突触可塑性改变,这些改变促进了慢性痛的维持,抑制岛叶兴奋性可缓解神经病理性痛。除了躯体痛,岛叶还接受由臂旁核和丘脑中继的一般内脏信息的传入,但是岛叶在慢性内脏痛的发展过程中的作用目前还少有报道。为解决上述问题,我们在本文中主要进行了两方面研究。第一部分研究中,我们首先综合光遗传学和化学遗传学方法明确了岛叶各亚区在痛觉信息传递与调控中的不同作用;随后利用束路示踪技术探讨了MD-aIC神经通路的解剖学特征;最后综合光遗传学和化学遗传学方法探讨了MD-aIC通路对痛觉信息传递及其负性情绪的调控作用。第二部分研究中,我们结合形态学、分子生物学、电生理学、药理学和化学遗传学方法观察了慢性胰腺炎（CP）内脏痛情况下aIC的突触可塑性改变及其分子机制,以及aIC对慢性胰腺炎内脏痛信息传递及其负性情绪的调控作用。本文分为以下四部分进行阐述:一.岛叶各亚区参与痛觉信息传递与调控的功能学研究目的:探讨岛叶各亚区在痛觉信息传递与调控中的不同作用。方法:本部分采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）的方法建立神经病理性痛模型,利用von Frey法测定足底机械痛阈（PWT）,利用旷场或高架十字迷宫实验检测动物的焦虑行为。（1）利用免疫组化技术观察SNI小鼠IC内FOS的表达变化;（2）向C57小鼠双侧aIC注入r AAV2/9-h Syn-h M3D（Gq）-m Citrine或r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO非特异性地兴奋和抑制aIC,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（3）向C57小鼠双侧p IC内注入r AAV2/9-h Syn-h M3D（Gq）-m Citrine或r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO非特异性地兴奋和抑制p IC,观察对正常和SNI模型小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（4）向C57小鼠双侧aIC注入r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,蓝光激活aIC锥体神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（5）向C57小鼠双侧p IC注入r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,蓝光激活p IC锥体神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和探索样行为的影响;（6）向GAD2-cre小鼠双侧aIC内注入r AAV-h Syn-DIO-h M3D（Gq）-m Cherry和r AAV-h Syn-DIO-h M4D（Gi）-m Cherry,腹腔注射CNO特异性兴奋和抑制aIC的GABA能神经元,观察对正常和SNI模型小鼠机械痛阈和探索样行为的影响。结果:（1）与sham组相比,SNI模型小鼠IC各部FOS阳性神经元数量均增加。（2）非特异性兴奋aIC不仅降低正常小鼠的PWT,还能减少动物在旷场中央区的活动时间,但对运动总路程没有影响;非特异性抑制aIC对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响。（3）非特异性兴奋p IC神经元降低正常小鼠的PWT,但对其旷场行为没有影响;对SNI小鼠的PWT和旷场行为也没有影响。（4）非特异性抑制p IC对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响;可缓解SNI小鼠的机械痛敏,但对旷场行为无影响。（5）激活aIC锥体神经元降低正常小鼠的PWT,减少动物在高架十字迷宫开放臂的活动时间,而对运动总路程没有影响。（6）激活p IC锥体神经元降低正常小鼠的PWT,但对其高架十字迷宫行为没有影响。（7）抑制aIC内GABA神经元可在正常小鼠上诱发机械痛敏;特异性激活aIC内GABA神经元可缓解SNI小鼠的机械痛敏和焦虑情绪。结论:IC各亚区均参与了神经病理性痛信息的传递或调控。激活aIC可在正常小鼠中引起机械痛敏和焦虑,而激活p IC仅在正常小鼠中诱发机械痛敏而非焦虑情绪。岛叶的促痛促焦虑作用是其锥体神经元介导的,而GABA神经元起到相反的作用,提示前馈抑制机制参与了岛叶内痛觉信息的处理。二.丘脑背内侧核-吻侧岛叶神经通路的形态学研究目的:探讨MD-aIC神经通路的神经解剖学特征。方法:（1）利用RV跨单突触逆行示踪系统对aIC和pIC内锥体神经元和GABA能神经元的单极传入神经元进行全脑筛查;（2）利用逆行示踪病毒证实MD内VGlu T2神经元投射到aIC;（3）利用顺行示踪病毒证实MD-aIC神经通路的存在;（4）利用AAV跨单突触顺行示踪系统证实MD向aIC内谷氨酸能神经元和GABA能神经元发出直接投射。结果:（1）我们将RV跨单突触逆行示踪病毒注入Ca MKIIa-cre和GAD2-cre小鼠的aIC,观察到aIC内锥体神经元和GABA能神经元的单极输入神经元在全脑的分布和数量没有明显区别。端脑中,同侧aIC、aIC附近皮质区、梨状皮质（Pir）、杏仁核（AMY）有大量投射神经元。丘脑中,MD、腹后内侧核（VPM）、丘脑后核（Po）和束旁核（PF）有大量投射神经元;腹后外侧核（VPL）、腹内侧核（VM）、丘脑下核（Sub）和丘脑腹后核小细胞部（VPPC）有中等量神经元;其他中线和板内核群有少量神经元。脑干中,逆标神经元可见于腹侧被盖区（VTA）、黑质致密部（SNC）、中缝背核（DR）和臂旁核（PBN）。（2）我们将RV跨单突触逆行示踪系统分别注入Ca MKIIa-cre和GAD2-cre小鼠的p IC,观察到p IC内锥体神经元和GABA能神经元的单极输入神经元在全脑的分布和数量没有明显区别。p IC的单突触传入神经元在端脑和脑干的分布与aIC相似,但在丘脑中有明显差异:VPPC和VPM和有大量神经元,VPL、Po和PF内有中等量神经元,MD几乎无神经元。（3）我们将逆行示踪病毒retro AAV2-h Syn-DIO-Ch R2-EYFP注入VGlu T2-cre小鼠的aIC内,在aIC全层均观察到大量EYFP标记的神经终末,在MD内侧部可看到EYFP标记的胞体。（4）我们将顺行示踪病毒r AAV2/9-Ca MKIIa-m Cherry注入C57小鼠的MD,可在同侧aIC无颗粒皮质观察到大量纤维终末。（5）我们向VGlu T2-cre和GAD2-cre小鼠MD内注入顺行跨突触示踪病毒sc AAV2/1-h Syn-FLEX-Flpo,向同侧aIC注入r AAV2/9-h EF1a-f DIO-EYFP,在两种小鼠同侧aIC无颗粒皮质区均可观察到GFP标记的神经元。结论:岛叶同一亚区内锥体神经元和GABA能中间神经元的全脑单极输入网络没有明显区别,而不同亚区的全脑单极输入网络存在明显差异,主要体现在丘脑:MD主要向aIC进行投射,而几乎不向p IC投射。MD谷氨酸能神经元向aIC的锥体神经元和GABA能神经元均存在直接突触联系。三.MD-aIC神经通路参与痛觉信息传递与调控的功能学研究目的:探讨MD-aIC神经通路在情感性痛觉信息传递和调控中的作用。方法:（1）向正常C57小鼠MD注入rAAV2/9-hSyn-hM3D（Gq）-m Citrine和r AAV2/9-h Syn-h M4D（Gi）-m Citrine,腹腔注射CNO兴奋和抑制MD,观察对其机械痛阈和旷场行为的影响;（2）向正常C57小鼠MD注入光遗传学病毒r AAV2/9-Ca MKIIa-Ch R2-m Cherry,在同侧aIC内置入光纤,蓝光刺激激活MD-aIC神经通路,观察对其机械痛阈和高架十字迷宫行为的影响;（3）将逆行示踪病毒retro AAV2/2-CMV-b Globin-cre注入正常C57小鼠的aIC,在MD内注入cre依赖的化学遗传学病毒rAAV-h Syn-DIO-h M3D（Gq）-m Cherry以兴奋向aIC投射的MD神经元,观察对正常小鼠机械痛阈和旷场行为的影响;（4）将RV单突触逆行示踪系统中的辅助病毒和RV-En VA-Ch R2-ΔG-ds Red分别注入建立SNI模型的GAD2-cre小鼠的aIC中,MD上方植入光纤以激活向aIC内GABA神经元投射的MD神经元,观察对SNI小鼠机械痛敏和旷场行为的影响。结果:（1）激活MD可降低正常小鼠的PWT,减少动物在旷场中的中央区活动时间,但对其运动总路程没有影响;抑制MD对正常小鼠的PWT和旷场行为没有影响,但可缓解SNI小鼠的机械痛敏。（2）利用光遗传学激活MD-aIC神经通路可降低正常小鼠的PWT,减少动物在高架十字迷宫开放臂的活动时间,但对其运动总路程无影响。（3）利用化学遗传学激活向aIC投射的MD神经元可降低正常小鼠的PWT,减少动物在旷场中央区的活动时间,但对其运动总路程没有影响。（4）特异性激活向aIC内GABA能神经元投射的MD神经元可缓解SNI小鼠的机械痛敏和焦虑情绪,但对其运动总路程没有影响。结论:激活MD降低正常小鼠的足底机械痛阈,诱发焦虑样情绪的产生,这与激活MD-aIC神经通路的效应是一致的,MD-aIC通路可能介导了情感性痛觉信息的传递。在该通路中,aIC内GABA能神经元通过前馈抑制对aIC内痛觉信息传递起到抑制作用。四.吻侧岛叶对慢性胰腺炎内脏痛信息传递的调控作用目的:探讨aIC对慢性胰腺炎内脏痛信息传递的调控作用。方法:（1）利用三硝基苯磺酸（TNBS）胰管注射法建立慢性胰腺炎大鼠模型,随后进行血清学指标与行为学检测,验证模型的建立是否成功;（2）利用免疫组化观察CP大鼠IC内FOS的表达变化,利用免疫印迹观察aIC内VGlu T1,NR2B和Glu R1的表达变化;（3）利用多通道场电位记录和全细胞膜片钳记录技术对CP大鼠aIC的兴奋性突触传递指标,突触可塑性指标和神经元兴奋性指标进行检测;（4）向双侧aIC注射AMPAR拮抗剂CNQX和NMDAR拮抗剂AP-5,观察对CP大鼠腹壁机械痛敏的影响;（5）向双侧aIC注入r AAV2/9-m Ca MKIIa-h M4D（Gi）-m Cherry,腹腔注射CNO特异性抑制aIC锥体神经元兴奋性,观察对CP大鼠腹壁机械痛敏和焦虑情绪的影响。结果:（1）TNBS组大鼠胰腺组织出现了腺泡萎缩和炎性细胞浸润等病理学改变,血清淀粉酶、脂肪酶和总胆红素明显增加;行为学检测表明TNBS组大鼠腹壁机械痛阈值明显降低,在旷场中的运动总路程和中央区运动路程减少。（2）与sham组相比,CP大鼠IC各部FOS表达上调。（3）场电位记录结果表明,与sham组相比,CP大鼠aIC的输入（刺激强度）-输出（激活通道的数目）曲线向左移动,TBS刺激后突触后场电位增加的斜率和幅度明显低于sham组。（4）通过全细胞膜片钳记录方式观察到,与sham组相比,CP大鼠aIC内Ⅱ-Ⅲ层锥体神经元的输入（注射电流强度）-输出（放电数目）曲线明显向左移动,rheobase current减少,静息膜电位上升;aIC的Ⅱ/Ⅲ层神经元s EPSC的频率和幅度均明显增强,双脉冲易化比值减小;AMPAR和NMDAR介导的EPSC的输入（刺激强度）-输出（EPSC幅值）曲线明显左移;AMPAR介导的EPSC的整流指数(I-40m V/I+50m V)明显增加,

摘要译文

关键词：

岛叶; 丘脑背内侧核; 神经病理性痛; 慢性胰腺炎内脏痛; 突触可塑性; 负性情绪; 光遗传学; 化学遗传学; 抑制性中间神经元

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

人体解剖与组织胚胎学

导师：

李云庆

中图分类号：

R338.3[感觉的中枢活动规律]

学科分类号：

071010[神经生物学];100105[医学生理学];100601[中西医结合基础医学];100908[应激医学]

D O I：

10.27002/d.cnki.gsjyu.2020.000020