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基于肾脏中胶原脯氨酰-4-羟化酶的抗纤维化药物的设计与合成认领

被引量： 1

作者：

顾一飞

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

纤维化的主要特征是细胞外基质的过渡沉积,而细胞外基质的主要成分是胶原蛋白。胶原蛋白的含量约占人体蛋白质总量的三分之一和人体皮肤干重的四分之三,其生物学合成过程主要包括一系列原胶原的翻译后修饰,其中修饰过程需要5种酶的参与,包括3种胶原蛋白羟化酶和2种胶原蛋白糖基转移酶。在3种胶原蛋白羟化酶中,胶原脯氨酰-4-羟化酶(C-P4H)能够将原胶原中(2S)-脯氨酸转化为成熟胶原蛋白三螺旋结构稳定所必需的(2S,4R)-4-羟基脯氨酸。因此C-P4H被认为是治疗纤维化疾病的重要靶点之一。现阶段C-P4H抑制剂的研究仍然处于起始阶段。已发现的C-P4H抑制剂都存在许多相同的问题,如细胞活性差,脱靶效应强,细胞毒性高。因此本课题首先在全面总结前期已报道的C-P4H抑制剂构效关系的基础上,设计、合成新型小分子化合物,以期寻找新的细胞活性佳的C-P4H小分子抑制剂。其次,C-P4H抑制剂的是否具有器官靶向性是能否成功研发C-P4H抑制剂的关键之一,因此本文还针对肾靶向载体连接片段进行研究。本课题的研究工作主要包括以下部分:一、化合物的设计、合成与细胞活性筛选在化合物的设计初始阶段,以基于C-P4H蛋白与C-P4H抑制剂形成的结合物模型的认知而提出的单侧吡啶环羧基邻位修饰方案以及文献总结的C-P4H抑制剂结构与活性关系为基础,在[2,2'-联吡啶]-5,5'-二羧酸的单侧羧酸邻位引入甲氧基,设计成新型4-甲氧基-2,2’-联吡啶骨架结构并进行结构修饰合成21个新型小分子化合物,然后在HSC-T6细胞中评价其抗纤维化细胞活性。研究结果表明:其中有15个化合物具有不同程度的细胞活性。此研究为进一步设计细胞活性更好的C-P4H抑制剂指明方向。在化合物深入设计阶段,以4-甲氧基-2,2’-联吡啶骨架结构,生物电子等排原理以及单侧吡啶环羧基间位修饰方案为基础,拟以双氮杂环(吡嗪,嘧啶,咪唑)替换4-甲氧基吡啶结构设计新型骨架结构,同时考虑到嘧啶具有多种生物活性,所以选择2-(2-吡啶基)嘧啶骨架为主要研究对象并进行结构修饰合成49个新型小分子化合物,然后在HSC-T6细胞中评价其抗纤维化细胞活性。研究结果表明:15个化合物对HSC-T6细胞的抑制活性强于阳性对照药吡非尼酮(PFD)、2,4-PDCA和bipy55'DC,其中6-(5-(对甲苯甲氨基甲酰基)嘧啶-2-基)烟酸乙酯(3-12q)和6-(5-(((3,4-二氟苯基)氨基甲酰基)嘧啶-2-基)烟酸乙酯(3-12u)的细胞的活性最佳,IC50值分别为45.69μM和45.81μM。最后,基于2-(2-吡啶基)咪唑骨架衍生物的C-P4H抑制活性和细胞活性,文献总结的构效关系以及单侧吡啶环羧基邻位或间位修饰方案,设计了三个系列咪唑并萘啶类骨架结构,并进行结构修饰合成了60个新型小分子化合物,然后在HSC-T6细胞中评价其细胞活性。该类化合物的溶解性和细胞活性较差。由于已知C-P4H抑制剂普遍无细胞活性,因此以增强目标化合物的细胞活性为主要目标。在化合物的设计、合成与细胞活性筛选阶段,共合成三大类131个新型小分子化合物,其中2-(2-吡啶基)嘧啶类化合物(3-12q和3-12u)表现出较好的抗纤维化细胞活性。研究结果证明了单侧吡啶环羧基邻位或间位修饰方案的可行性,并为下一步研究奠定基础。二、化合物3-12q与3-12u的抗纤维化机制研究基于131个化合物的细胞活性筛选结果,选择化合物3-12q和3-12u进行抗纤维化机制研究。本文采用天狼猩红染色实验测试化合物3-12q和3-12u对总胶原蛋白的抑制情况;采用ELISA实验检测化合物3-12q和3-12u对I型胶原蛋白的影响;采用羟脯氨酸含量测定的方法判断化合物3-12q和3-12u对C-P4H的抑制情况。研究结果表明:1.化合物3-12q和3-12u能够以剂量依赖性的方式降低HSC-T6细胞中总胶原蛋白的含量,且明显好于阳性对照药吡非尼酮。2.化合物3-12q与3-12u能够明显减少HSC-T6细胞中I型胶原蛋白的含量,且化合物3-12q的作用效果稍微强于化合物3-12u。三、谷氨酰胺肾靶向载体连接片段的设计、合成与体外释放C-P4H蛋白在人体大部分器官中广泛表达,将C-P4H抑制剂送达肾脏,而不影响其它正常器官的功能已成为能否将C-P4H抑制剂用于肾纤维化疾病治疗的关键之一,因此本文对肾靶向载体连接片段进行研究。基于N5-苯基谷氨酰胺能够被肾脏中丰富存在的γ-谷氨酰转肽酶快速识别转化,从而设计合成全修饰谷氨酰胺肾靶向载体连接片段,并在体外考察其释放药物活性成分的能力。研究结果表明,化合物S4682-Gln能够在PBS缓冲溶液中稳定存在,而当仅有γ-谷氨酰转肽酶存在的情况下,化合物S4682-Gln释放出部分C-P4H抑制剂S4682,说明所设计的新型全修饰谷氨酰胺载体连接片段具有潜在的肾靶向性作用。但是进一步实验发现这类化合物在血浆中不稳定。该研究成果为进一步研究肾靶向性C-P4H抑制剂奠定基础。综上所述,本论文以增强C-P4H抑制剂细胞活性为主要目标。以基于对已报道的C-P4H蛋白与C-P4H抑制剂形成的结合物模型的认知而提出的单侧吡啶环羧基邻位或间位修饰方案和对已报道全部C-P4H抑制剂构效关系的分析总结为基础,共设计五种相互联系的新型骨架结构,成功合成131个新型小分子化合物。这些化合物拓展了C-P4H抑制剂的结构类型。通过HSC-T6细胞评价化合物的抗纤维化细胞活性,其中2个化合物(3-12q和3-12u)在细胞中表现出较好的活性,并且能够以剂量依赖性的方式减少HSC-T6细胞中的I型胶原蛋白和总胶原蛋白的含量。此外谷氨酰胺肾靶向载体连接片段的研究也为肾靶向C-P4H抑制剂的研究奠定靶向基础。而化合物深入的生物作用机制和化合物对C-P4H蛋白的具体抑制率测试工作仍在进行中。

摘要译文

关键词：

胶原; 脯氨酰-4-羟化酶; 抑制剂; 生物活性; 合成

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

药物化学

导师：

柏旭

中图分类号：

R914[药物化学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100701[药物化学];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27162/d.cnki.gjlin.2021.000165