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小黑杨单倍体悬浮细胞筛选体系的建立及应用研究认领

被引量： 6

作者：

刘彩霞

学位授予单位：

东北林业大学

摘要：

植物悬浮细胞可为植物研究提供一个简化的模型系统,它的开发和应用目前主要集中在草本植物和农作物中,在林木中的应用研究还鲜有报道。与草本植物相比,木本植物具有明显的次生生长特点,使其在应激反应调节,信号转导调控等方面存在差异,因此在诸多科研探究中,草本植物悬浮细胞系具有明显的局限性,不能够完全替代木本植物细胞系进行研究。小黑杨(Populus simonii ×P.nigra)是在上世纪五六十年代由育种工作者人工杂交选育而成,以欧洲黑杨和小叶杨为父母本,由于生长快,适应性强,兼具耐寒、耐旱、耐盐碱等特点而被广泛种植。本文以小黑杨为研究材料,通过对小黑杨花药进行愈伤诱导,通过对单倍体群体的筛选,从而获得具有优良性状的单倍体细胞系Qu-1,并对Qu-1 在分子生物学上的应用进行了深入研究,建立了系统的小黑杨单倍体细胞系应用体系,揭示了小黑杨单倍体细胞系具有广泛的应用前景和价值,可为植物领域尤其是林木分子生物学研究提供优良的试验材料。其主要研究结果包括:(1)小黑杨单倍体愈伤组织诱导体系的建立:通过对本地区小黑杨的物候情况进行观察,小黑杨雄蕊于每年3月开始萌动,4月中旬可观察到花药处于不同的发育时期。以不同发育时期的小黑杨花药为外植体,经常规消毒处理后,进行愈伤组织诱导,并对获得的愈伤进行继代培养,流式细胞仪倍性检测,k-mer分析以及植株再生诱导等一系列实验。通过对愈伤组织诱导情况进行统计,共获得3000个愈伤组织,同时发现当花药处于单核靠边期时,诱导效率最高;经杂合度及倍性检测最终获得300个单倍体愈伤组织,其中有20个单倍体愈伤组织已经获得完整植株。(2)小黑杨单倍体悬浮细胞系Qu-1培养体系的建立:从可再生植株的单倍体愈伤组织中挑选颜色淡黄、质地松散以及生长旺盛的愈伤Qu-1作为悬浮培养的材料,通过对不同激素比例浓度的调节筛选出最适合的悬浮培养条件,结果表明,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的最适悬浮培养基是MS+1.25 mg/L 2,4-D+ 0.2 mg/L KT+50 g/L蔗糖,pH为6.0,最佳培养温度及转数为26℃,110 rpm,最佳接种量为0.023 g/mL,培养周期为10 d。(3)小黑杨单倍体细胞系Qu-1生长特性的研究:通过与BY-2细胞系在固体培养和悬浮培养状态下的生长量,分散性以及细胞大小比较分析表明,Qu-1较BY2细胞系在悬浮培养时表现出生长速度更为旺盛且具有良好分散性等特点;同时对Qu-1细胞系进行木材组分测定和植株再生诱导,结果表明,Qu-1细胞系在悬浮培养状态下木质素总含量为8.33%,S/G 比例为3.51。经过不定芽诱导,Qu-1细胞系可以再生形成完整植株。(4)小黑杨单倍体细胞系Qu-1全基因组测序:Qu-1细胞系基因组测序采用三代PacBio和二代测序两种技术相结合的方式,依赖三代测序长读长的特点,保证更完整的基因组组装,并使用二代测序数据校正,保证组装结果更精确可靠。同时结合Hi-C等新技术,将Qu-1细胞系基因组组装到染色体水平,从而为后续分析提供精准而全面的基因组信息。最终组装得到的Qu-1细胞系基因组大小为397.9 Mb,contig N50为6.7 Mb,scaffold N50为20.6 Mb,GC含量为33.8%;最终注释的重复序列总计196,327,743 bp,占全部基因组序列的49.3%。(5)小黑杨单倍体细胞系Qu-1瞬时遗传转化体系的建立:以农杆菌介导的瞬时遗传转化操作中,通过对Qu-1细胞系瞬时遗传转化中的几个主要因素进行单因素比较试验,建立了有效的Qu-1细胞系的瞬时遗传转化体系,结果表明,将悬浮培养6 d的Qu-1细胞系与含有以水为溶剂OD600为0.2的农杆菌菌液,0.75 mM AS和0.0002 mg/L TDZ的侵染悬液在26℃,110 rpm共培养2 d时,Qu-1细胞系的瞬时遗传转化效果最好;在以原生质体介导的瞬时遗传转化操作中,选择培养8-9 d的Qu-1细胞系进行原生质体分离,原生质体得率最高,转化效率可达30～35%,利用Qu-1原生质体分离及转化系统已进行多种细胞器定位及BiFC试验。(6)小黑杨单倍体细胞系Qu-1稳定遗传转化体系的建立:对Qu-1细胞系进行过表达,RNAi抑制表达以及CRISPR/Cas9基因编辑的遗传转化试验,通过对抗性愈伤进行常规的分子检测,结果表明,抗性筛选25-30 d即可获得抗性愈伤;DNA分子水平检测显示外源基因已整合到 Qu-1 细胞系基因组上,RNA分子水平检测显示,过表达与RNAi抑制表达的目的基因在不同转基因愈伤中相对表达量存在差异;通过基因编辑获得的转基因愈伤,为纯合突变株。(7)小黑杨单倍体细胞系Qu-1响应ABA处理分析:设置不同浓度梯度ABA对Qu-1细胞系进行不同时间处理,通过对处理后Qu-1细胞系的活性检测,以及对已有报道的应答基因进行定量分析,确定最适的ABA处理浓度,从而建立Qu-1细胞系ABA处理体系。利用100 μM ABA对Qu-1细胞系处理0 h,0.5 h,4 h,12 h和24 h并进行转录组分析,结果表明Qu-1细胞系具有与已知报道的ABA相同的应答通路,鉴于其胁迫处理操作简单方便,可以作为优良的模型系统进行胁迫处理研究。综上所述,小黑杨单倍体细胞系Qu-1的获得及开发应用表明其具有巨大的潜力成为植物领域尤其是林木分子生物学研究的模式细胞系,为相关领域研究提供重要的帮助。

摘要译文

关键词：

植物悬浮细胞系; 小黑杨单倍体; Qu-1; 植株再生; 基因组; 瞬时遗传转化; 稳定遗传转化

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

林木遗传育种

导师：

杨传平曲冠证

中图分类号：

S792.11[杨⑨]

学科分类号：

0907[林学]

D O I：

10.27009/d.cnki.gdblu.2021.000102