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FSTL1通过增强细胞自噬促进COPD的气道炎症与气道重塑认领

被引量： 7

作者：

刘颖

学位授予单位：

山东大学

摘要：

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是被公认的危及生命的呼吸系病,随着老龄化社会的临近,该病对人类健康的影响程度将日益加重。目前,我国40岁以上人群患病人数已经超过1亿。COPD主要表现为持续的气流受限和与气道重塑、气道炎症相关的肺气肿。COPD气道重塑涉及气道平滑肌与淋巴滤泡增生,气道外壁胶原沉积增多等一系列气道结构的改变。同时COPD也是一种复杂的炎症性疾病,多种不同类型的炎症细胞和介质被涉及其中。在该病发生、发展过程中,复杂的先天因素如宿主因素与外在因素如吸烟、环境空气污染等共同加重疾病进程。虽然现代医学认为COPD可防可治,但是到目前为止仍然没有精准的治疗方法可以有效控制疾病的进展。总而言之,在COPD发病机制方面,还需要更深入的研究来回答和解决一些关键问题。卵泡抑素样蛋白1(Follistatin-like protein 1,FSTL1)也被称为卵泡抑素相关蛋白(Follistatin related protein,FRP)。它参与包括细胞凋亡、新陈代谢、免疫反应及内分泌等生理过程。同样,FSTL1也被证明在不同信号通路的调节中发挥作用。目前已知FSTL1与多系统疾病相关,包括循环系统疾病、恶性肿瘤以及免疫相关性疾病等。FSTL1参与调节肺脏的发育与成熟。有研究表明FSTL1缺失会导致小鼠出生后死亡,主要是由于肺发育的多种缺陷导致呼吸衰竭。在呼吸相关疾病方面,FSTL1被证实介入特发性肺纤维化、肺部感染、哮喘等疾病过程。同时FSTL1还是一种新型的炎症介质,在炎症细胞的调节中表现出关键作用。而炎症是多种慢性呼吸系统疾病的特征性改变,尤其是COPD的主要特征。有研究发现合并肺动脉高压的COPD患者血清FSTL1 水平较高。机体需要定期对自身物质进行降解,以此更新自我,保护自我。这种机制依赖溶酶体完成,这一过程被称为自噬。因此,自噬调节功能障碍可以引发多种疾病。有研究表明自噬相关蛋白ATG 8/微管相关蛋白-1LC3是COPD的候选分子靶点。进一步研究证实自噬相关蛋白可能与COPD肺气肿的形成相关。临床研究发现COPD患者自噬水平升高,与预测的肺通气功能指标第一秒用力呼气容积(Forced Expiratory Volume in 1 second,FEV1)呈负相关,与循环中的促炎细胞因子白介素-8(Interleukin 8,IL-8)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)呈正相关。因此,自噬是评估COPD发病及严重程度的重要指标。综合分析以上研究结果,我们认为FSTL1与自噬应该与COPD的气道炎症与气道重塑密切相关。然而FSTL1与自噬的相互关联如何?二者如何在介导COPD气道炎症与气道重塑中发挥作用,均未见报道。针对以上问题,本课题主要针对FSTL1和自噬进行研究,对它们如何在香烟诱导的COPD气道炎症与气道重塑中发挥作用进行探索,进一步拓展对COPD发病机制的认识,并积极寻找可能对COPD疾病进程进行有效干预的治疗措施。研究目的探究FSTL1介导COPD气道炎症和气道重塑的机制,发现在COPD疾病进程中可能减轻气道炎症与气道重塑的有效靶点。研究方法1.COPD患者FSTL1水平与自噬的表达。1.1病例选取选取2017年1月至2018年1月就诊于山东大学齐鲁医院的稳定期COPD患者(n=25),取患者静脉血。对照组(n=28)血液标本来源于就诊的非COPD患者。COPD组肺组织标本(n=7)来自于因疑似或确诊肺癌而行肺切除的COPD患者。对照组的肺组织标本(n=6)来源于齐鲁医院遗体捐赠中心,取材尸体生前无COPD病史,死因排除呼吸系统疾病。所有受试者均无其他呼吸相关疾病,如哮喘、间质性肺病、矽肺以及感染性肺部疾病。本课题经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准,并已取得书面知情同意。1.1.1 COPD组纳入标准:(1)诊断依据GOLD2016相关标准,明确诊断为COPD,并对其进行肺功能分级。1.1.2排除标准:(1)近1月内发作心绞痛(稳定型/不稳定型)、诊断冠心病心肌梗死、肺栓塞、脑梗死。(2)存在重度高血压病,收缩压>180mmHg,或舒张压>120 mmHg。(3)伴有恶性心律失常。(4)身体极度虚弱。(5)有精神疾病和类风湿关节炎者。1.2 HE(hematoxylin&eosin)染色观察受试者肺组织病理表现。1.3免疫组化染色检测受试者肺组织标本中FSTL1、自噬标记物LC3B的表达。1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)检测评价COPD患者与对照组血清FSTL1 水平。2.FSTL1和自噬对CS诱导COPD气道炎症与气道重塑的影响。2.1动物分组:①实验小鼠为C57BL/6雌性野生型小鼠(Wild type,WT),体重为20±3g,8周龄,购自山东大学动物实验中心。小鼠生活在无病原菌的室温条件,生活具有昼夜节律,可以自由获得饮水及标准实验室喂养饲料。②FSTL1flox/+小鼠由南京大学高翔教授和中国科学院上海生物科学研究所神经研究所徐章教授慷慨赠送。③cmv-Cre小鼠于南京大学动物实验中心购进。④FSTL1+/-小鼠:通过FSTL1flox/+小鼠与cmv-Cre小鼠交配,在其子代小鼠中,需要通过基因检测以确定基因型。2.2动物分组及模型建立:2.2.1分组随机分为 3 组,每组 6 只。包括,CON-FSTL1flox/+,CS-FSTL1flox/+,CON-FSTL1+/-,CS-FSTL1+/-.CON-WT,CS-WT,CS+3MA-WT 组。2.2.2 CS 诱导CS诱导为期12周,每周6天,每天2次,每次使用4只哈德门过滤嘴香烟(焦油含量10毫克,尼古丁 1.0毫克,一氧化碳12毫克),使用自制熏笼进行CS诱导。对照组小鼠在相同条件下暴露于室内空气中。2.2.3 3-甲基腺嘌呤干预3-甲基腺嘌呤(Sigma,美国)进行腹腔内注射,为期12周,注射剂量20mg/kg/天。对照组使用同等体积生理盐水,同样给药方法与频率注射。注射于每日首次CS诱导开始前2h完成。2.3 HE(hematoxylin&eosin)染色观察实验小鼠肺组织病理表现。2.4免疫印迹分析、免疫组化染色观察实验小鼠肺组织标本中FSTL1、自噬标记物 LC3B、P62 以及 collagen 1、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)的表达。2.5酶联免疫吸附试验分析评价实验小鼠肺泡灌洗液中炎症因子白细胞介素8、肿瘤坏死因子α及白三烯B4水平。2.6肺功能检测实验小鼠肺总量与肺顺应性。2.7透射电镜观察小鼠气道上皮细胞中自噬小体的表达。结果1.COPD患者与对照组患者在性别、年龄、BMI方面,其差异无统计学意义。COPD患者的肺组织标本HE染色显示气道上皮炎症细胞浸润、网状基底膜破裂、气道上皮完整性缺失以及纤毛倒伏等病理学改变。2.免疫组化染色显示COPD患者气道上皮细胞和肺间质中FSTL1与LC3B的表达明显高于对照组,COPD组与对照组存在显著差异。3.酶联免疫吸附试验检测血清FSTL1水平,结果显示COPD患者FSTL1水平明显高于对照组,COPD组与对照组存在显著差异。4.FSTL1在CS诱导COPD野生型(CS-WT)小鼠的气道上皮细胞与肺间质内高表达。免疫印迹和免疫组化染色结果显示与CON-WT小鼠相比,CS-WT小鼠气道上皮细胞和肺间质内FSTL1高表达。5.CS诱导COPD小鼠自噬水平升高,同时伴有气道炎症因子与气道重塑标记物表达增多。与CON-WT小鼠相比,CS-WT小鼠具有如下改变:免疫组化染色与免疫印迹分析结果显示气道上皮细胞内LC3B、P62、collagen Ⅰ与α-SMA表达增加。透射电镜观察到气道上皮细胞内自噬小体形成增多。酶联免疫吸附试验分析显示支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8和LTB4水平显著升高。6.实验小鼠体内使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬可以减轻CS-WT小鼠的气道炎症与气道重塑。免疫组化与免疫印迹分析结果显示,与CS-WT小鼠相比,CS+3MA-WT小鼠表现出较低水平的collagen Ⅰ、α-SMA的表达,支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-8和LTB4水平也较CS-WT小鼠减低。7.条件性敲除FSTL1基因可以减轻CS诱导的自噬激活。CS诱导后FSTL1flox/+小鼠LC3BⅠ向LC3BⅡ的转换增多,同时,自噬小体的形成增加。然而,在同样的CS诱导下,CS-FSTL1+/-小鼠的上述改变弱于CS-FSTL1flox/+小鼠。8.条件性敲除FSTL1基因可以减轻CS诱导COPD小鼠的气道炎症与气道重塑。免疫组化染色和免疫印迹分析显示,与CS-FSTL1flox/+小鼠相比,CS-FSTL1+/-小鼠collagen Ⅰ和α-SMA的表达减低。同时,CS-FSTL1+/-小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-8、LTB4和TNF-α表达水平低于CS-FSTL1flox/+小鼠。9.条件性敲除FSTL1基因与使用自噬抑制剂体内干预均可减缓CS诱导COPD小鼠肺功能的下降。CS-WT小鼠、CS-FSTL1fox/+小鼠肺总量和肺顺应性增高。CS+3MA-WT小鼠的上述改变弱于CS-WT小鼠。CS-FSTL1+/-小鼠的上述改变弱于CS-FSTL1flox/+小鼠。以上实验结果表明COPD患者同时存在FSTL1及自噬高表达。条件性敲除FSTL1基因与自噬抑制剂均可减轻CS诱导COPD的气道炎症与气道重塑。FSTL1通过增强自噬水平促进COPD气道炎症与气道重塑的发生。结论1.香烟诱导的COPD细胞自噬水平增强。2.条件性敲除FSTL1基因与体内使用自噬抑制剂干预均可改善香烟诱导COPD的气道炎症与气道重塑。3.FSTL1通过增强自噬促进香烟诱导的COPD气道炎症与气道重塑。4.FSTL1与自噬均可能成为COPD治疗的潜在靶点。

摘要译文

关键词：

卵泡抑素样蛋白1; 气道炎症; 自噬; COPD

学位年度：

2021

学位类型：

博士

学科专业：

内科学（呼吸系病）（专业学位）

导师：

董亮

中图分类号：

R563.9[其他⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2021.000423