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MFAP4在心肌重构中的作用及其机制研究认领

被引量： 3

作者：

王辉波

学位授予单位：

武汉大学

摘要：

背景心力衰竭是各种类型心血管疾病的最终归宿,是严重威胁人类健康和生活质量的常见疾病。心肌重构是指心脏为适应各种类型心血管疾病引起的心脏前后负荷增加、多种细胞因子及神经体液的作用下,其结构和功能上发生的适应性代偿作用,这些负荷和神经体液因子长期持续最终失代偿引起心力衰竭。心肌重构主要表现为心肌肥厚（心脏体积、重量、心室壁厚度、心肌细胞横截面积的增加,几何形状的改变）、心肌间质和血管周围纤维化（细胞外基质的增加、心脏顺应性改变）、常常伴有心脏收缩功能改变（射血分数、左室短轴缩短率的降低）、心脏电重构（各种类型的房性和室性心律失常的发生率增加）。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是一种存在于所有组织中的三维非细胞结构,其不仅发挥维持组织完整性的机械支持作用,而且还作为信号中枢和生长调控因子的储存库,传递对各种细胞功能调控发挥重要作用的级联信号,以调节细胞活动和修复程序。心肌纤维化的主要病理特征是ECM成分在心肌血管周围和间质中过度积聚,ECM的形态和生化变化可能与HF发病机制和预后密切相关。微纤维相关蛋白4（microfibrillar-associated protein 4,MFAP4）,是纤维蛋白原相关蛋白超家族一种36 k Da的ECM糖蛋白,其有一个短的N-末端区域,该区域含有一个与整合素相结合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid,RGD）序列。MFAP4在富含弹性蛋白的组织中高度表达,在心脏相对表达量较高,MFAP4的具体生物学功能尚未完全阐明,但其通过整合素介导血管SMCs激活和增殖,导致动脉狭窄和促炎作用已在体内得到证实。MFAP4与重构相关疾病密切相关,包括肝纤维化、动脉粥样硬化、动脉损伤刺激重构、哮喘等。然而,到目前未有相关文献报道MFAP4在心肌重构中发挥何种生物学作用。本课题旨在通过生物信息学技术,筛选心肌重构中的差异表达基因,预测MFAP4在心肌重构过程中表达升高,结合MFAP4在肝脏纤维化、血管重构、气管重构等疾病的作用及机制,提示MFAP4可能参与了心肌重构发生与发展过程。本实验采用压力超负荷和异丙肾上腺素构建小鼠心肌重构模型,观察MFAP4在重构的心肌组织中的表达改变情况;并且构建MFAP4基因敲除小鼠,研究MFAP4在心脏结构性重构和电重构中的作用及其机制,为心力衰竭过程中心脏病理性重构的防治提供一定的理论基础。方法实验一:通过GEO数据库搜索并下载关于小鼠心肌重构的芯片数据集,使用R软件Limma包进行数据处理,包括背景校正、归一化处理、对数转换和差异表达基因（DEGs）的筛选。在本研究中,将有统计学意义的DEGs定义为log2FC>1或者log2FC1（FC=fold change）,且调节后的P值<0.05;使用R软件分别绘制这些筛选出的DEGs的火山图和热图;使用Venny网站对多组芯片数据集取交集,得到共同的DEGs;我们通过DAVID 6.8网站对筛选出来的DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用STRING网站分析蛋白质-蛋白质相互作用;建立压力超负荷心肌重构模型,运用RT-PCR对筛选的DEGs进行初步验证;通过Western blot和免疫组化对确定的MFAP4进行进一步实验验证。实验二:构建MFAP4基因敲除小鼠,选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠（KO）和相应的同窝对照野生型小鼠（WT）,将其随机分为异丙肾上腺组（ISO）和对照组（Control）,分别注射50 mg/kg ISO或等体积生理盐水,连续注射2周后用心脏超声评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织（分生或病理）,记录心重（HW）、体重（BW）和胫骨长度（TL）的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的心肌细胞横截面积（CSA）(HE染色、WGA染色)和心肌间质区内的胶原含量（PSR染色）;通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平。实验三:选8-10周龄MFAP4基因敲除小鼠（KO）和相应的同窝对照野生型小鼠（WT）,将其随机分为主动脉缩窄组（AB）和假手术组（Sham）,AB术后8周采用心脏超声和血流动力学评估小鼠的心功能;根据实验要求收集心脏组织（分生或病理）,记录HW、BW和TL的数值并计算HW/BW和HW/TL比值;通过病理染色来评估各组小鼠的CSA（HE染色、WGA染色）和心肌间质区内的胶原含量（PSR染色）;通过RT-PCR和Western blot检测心肌肥厚和纤维化的分子标记物的m RNA和蛋白表达水平;Western blot检测各组小鼠心肌组织中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;体表心电图记录各组小鼠RR间期、PR间期、QRS波和QT持续时间;制备各组小鼠Langendorff离体心脏模型,记录离体心脏左室前游离壁的单相动作电位（MAP）,用S1-S1起搏刺激确定APD90和APD交替阀值（ALT）;用Burst刺激诱导室性心动过速（ventricular tachycardia,VT）,计算VT的诱发率;Western blot检测各组小鼠缝隙连接蛋白（connexin,Cx43）的表达。实验四:提取大鼠乳鼠原代心肌细胞（CMs）和原代成纤维细胞（CFs）,RT-PCR比较CMs和CFs的MFAP4基础表达水平;分别用Ang II、PE、TGFβ刺激CMs和CFs,RT-PCR检测纤维化或肥厚标志物,以及MFAP4的表达水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因沉默（Ad-sh MFAP4）,并使用TGFβ刺激,RT-PCR比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物（α-SMA、Col1α、Col3和FN）表达水平;Western blot检测各组细胞中FAK及下游信号通路分子磷酸化水平;通过腺病毒介导CFs的MFAP4基因过表达（Ad-MFAP4）,通过加入FAK信号通路的抑制剂（PND-1186）和TGFβ刺激,比较各组细胞的肌成纤维细胞标志物表达水平,判断MFAP4发挥其生物学作用是否依赖于FAK及下游信号通路。结果实验一:从GEO搜索并下载到4组芯片数据集（GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348）;利用R软件从GSE5500、GSE18224、GSE36074和GSE56348中分别筛选出188、293、253和67个DEGs;利用Venny网站选出在这4个不同的实验中共同差异表达的基因,有23个基因表达升高（Ltbp2、Postn、Cilp、Mfap4、Thbs4、Col8a1、Timp1、Nppa、Gdf15、Pamr1、Lox、Acta1、Itgbl1、Ctgf、Cnksr1、Frzb、Mfap5、Meox1、Tgfb2、Aqp8、Fstl1、Aspn、Srpx2）,1个基因表达降低（Retnla）;通过DAVID 6.8网站对24个DEGs进行GO功能富集分析,发现它们显著富集于细胞外纤维组织、细胞粘附、伤口愈合、胞外区、胞外基质、生长因子活性等生物学功能;我们建立TAC介导的心肌重构模型,对未被证实的15个DEGs基因进行RT-PCR验证,发现显著升高了Itgbl1、Aspn、Fstl1、Mfap5、Col8a1、Ltbp2、Mfap4、Pamr1、Cnksr1、Aqp8、Meox1、Gdf15、Srpx基因的表达,降低了Retnla（P<0.05）;对确定的MFAP4进行进一步实验验证,MFAP4水平在AB后1周略有升高,在AB后2、4、6和8周显著上调（P<0.05）;同时免疫组织化学染色显示,AB后8周MFAP4在左心室的表达均明显高于假手术组。实验二:腹腔注射ISO较对照组显著增加了MFAP4基因在心肌中的表达,注射ISO 2周后较注射生理盐水组相比,小鼠心功能明显恶化（P<0.05）,而MFAP4缺乏可显著改善ISO诱导的心功能降低（P<0.05）;WT-ISO组小鼠的HW/BW、HW/TL比值显著高于WT-Con组小鼠（P<0.05）,然而KO-ISO组和WT-ISO组之间没有显著差异（P>0.05）;对比CSA,KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有显著差异（P>0.05）;此外,心肌肥厚的标志物的表达在KO-ISO组和WT-ISO组之间也没有差异（P>0.05）;WT-ISO心脏与WT-Con相比,血管周围和间质胶原容积显著增加（P<0.05）,MFAP4基因缺失小鼠会使得ISO刺激后胶原容积显著减少（P<0.05）;RT-PCR和Western blot检测心肌纤维化标志物在野生型小鼠ISO组中明显上调（P<0.05）,MFAP4基因敲除能够降低上述基因的上调的程度（P<0.05）。实验三:AB术后8周的WT小鼠的心功能和血流动力学出现了显著恶化（P<0.05）,MFAP4基因敲除后心功能得到相应的缓解（P<0.05）;压力超负荷WT小鼠的HW/BW、HW/TL、心肌细胞CSA、心肌肥厚标志物显著增加（P<0.05）,然而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均没有显著差异（P>0.05）;AB 8周后,血管周围和间质胶原容积、心肌组织纤维化标志物显著增加（P<0.05）,而MFAP4基因敲除的小鼠在AB术后与WT-AB组相比,这些指标均显著下降（P<0.05）;AB 8周后,FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而其磷酸化水平在MFAP4-KO小鼠中被强烈下调（P<0.05）;AB 8周后,4组小鼠之间PR间期和RR间期均没有显著改变（P>0.05）;WT-AB组小鼠较WT-Sham组相比显著增加了QRS波时间和QTc间期（P<0.05）,而MFAP4缺失后会显著降低AB手术介导的QRS波时间和QTc间期的延长（P<0.05）;AB诱导的野生型小鼠组与野生型Sham组的离体心脏灌流实验相比,APD90和ALT显著延长、VA诱导率显著增高、Cx43的表达降低（P<0.05）,而MFAP4-KO组在AB后与WT-AB组相比APD90和ALT显著缩短、VA诱导率显著降低、Cx43的表达升高（P<0.05）。实验四:CFs的MFAP4 m RNA表达水平较CMs相比高43.90倍（P<0.001）;Ang II、PE和TGFβ刺激CFs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.743倍（P<0.001）、1.397倍（P<0.05）、2.895倍（P<0.001）;Ang II、PE和TGFβ刺激CMs后,MFAP4的m RNA表达水平分别升高1.253倍（P<0.05）、1.26倍（P>0.05）、1.485倍（P<0.001）;TGFβ刺激显著增加了CFs纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平（P<0.05）,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组明显降低了纤维化标志物表达水平;免疫荧光显示,TGFβ刺激增加了纤维化标志物α-SMA的荧光强度,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了α-SMA的荧光强度;TGFβ刺激增加FAK及下游的PI3K-AKT和MEK1/2-ERK1/2的磷酸化激活,而加入sh MFAP4的TGFβ刺激组降低了这些蛋白的磷酸化活化（P<0.05）;而Ad-MFAP4进一步增加了TGFβ刺激CFs的纤维化标志物α-SMA、Col1α、Col3和FN的m RNA表达水平,而使用了FAK抑制剂（PND-1186）则弱化了Ad-MFAP4对TGFβ刺激CFs的纤维化标志物的增加作用（P<0.05）。结论1.MFAP4在发生重构的心肌组织中明显升高,且在心脏成纤维细胞表达显著高于心肌细胞表达;2.MFAP4基因缺失在异丙肾上腺素诱导的心肌重构中发挥了改善心功能、抑制纤维化的作用,对肥厚无显著影响;3.MFAP4基因缺失在压力负荷诱导的心肌重构中发挥了改善心功能和血流动力学、抑制纤维化、降低室性心律失常发生率的作用,对肥厚无显著影响;4.

摘要译文

关键词：

MFAP4; 细胞外基质; 局部粘附斑激酶; 心肌重构; 纤维化

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

内科学

导师：

唐其柱

中图分类号：

R541.6[血液循环衰竭⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27379/d.cnki.gwhdu.2020.000020