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当归及其鲜品、当归叶补血功效的谱效关系及质量标志物研究认领

作者：

刘洁丽

学位授予单位：

甘肃中医药大学

摘要：

当归(Angelica sinensis（Oliv）Diels)是中医临床常用药材之一,传统药用部位为其干燥根。当归的化学成分主要有多糖、有机酸、挥发油等,具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效,中医临床常以单味药或复方的形式用于血虚证的治疗。当归的质量控制方法一般采用色谱法测定其中一种或几种指标成分的含量,但是所检测的指标成分没有和当归的功效相关联,因此筛选出与当归功效密切相关的质量标志物,对当归的质量控制方法研究具有重要的意义。当归鲜品因其不经过任何干燥处理,避免了干燥过程中药效成分的变化。将当归鲜品榨汁,其汁在保留了当归有效成分的同时也防止部分对热不稳定的化学成分在加热提取过程中化学结构发生改变。中药鲜品榨汁液的临床应用自古有之,将中药榨汁液利用现代技术干燥后,贮藏和携带更加方便。本课题组前期研究发现,当归鲜品对血虚小鼠有明显的治疗作用,但药效物质基础尚未明确,因此,对当归鲜品补血功效的药效成分进行研究,同时筛选出与补血功效相关的质量标志物,可以为当归鲜品的应用提供一定的科学依据。当归叶为当归的非药用部位,常在当归采收前15天左右割掉弃之。本课题组前期研究发现,当归叶中的部分化学成分与当归相同,并且当归叶具有一定的补血功效,对当归叶的补血药效成分进行研究,可以为进一步发现当归叶的药用价值奠定理论基础。本论文以当归、当归鲜品和当归叶为研究对象,以筛选与补血功效相关的质量标志物为目的,采用现代分析技术和药学评价手段,结合代谢组学和网络药理学,对当归、当归鲜品、当归叶的补血药效物质基础和补血作用机制进行研究;通过建立指纹图谱与药效指标之间的谱效关系、化学成分与内源性标志物之间的相关分析、预测化学成分的关键作用靶点,初步筛选出补血药效成分,将“谱效关系-代谢组学-网络药理学”相关联,筛选出当归、当归鲜品、当归叶中与补血功效相关的质量标志物。本论文的主要内容及研究结果如下: 1.当归、当归鲜品和当归叶的化学成分分析采用UPLC-Q-TOF-MS分析当归、当归鲜品和当归叶的化学成分,建立色谱指纹图谱,结果显示三组样本色谱峰的数量、保留时间和峰面积均有较大差异。对化学成分进行分析,结果显示:当归和当归鲜品有13个共有成分,共有成分在当归和当归鲜品中的相对峰面积分别为49%和94%,差异成分主要来源于当归中的有机酸和大极性成分;当归和当归叶有22个共有成分,共有成分在当归和当归叶中的相对峰面积分别为29%和36%,差异成分主要来源于当归叶中的大极性成分。通过质谱解析和标准品比对,共鉴定了13个化学成分的结构:正离子模式下4#峰为腺苷、7#峰为苯丙氨酸、23#峰为阿魏酸、33#峰为环七（异）亮氨酸、39#峰为丁烯基苯酞、44#峰为洋川芎内酯A;负离子模式下的1#为柠檬酸、3#峰为新绿原酸、7#峰为绿原酸、8#峰为隐绿原酸、10#峰为咖啡酸、11#峰为香草酸、14#峰为5-O-阿魏酰奎宁酸。用水蒸气蒸馏法提取当归、当归鲜品和当归叶的总挥发油,测定总挥发油含量,结果表明总挥发油含量从高到低依次为:当归鲜品(0.92 m L·100 g-1)>当归(0.62 m L·100g-1)>当归叶(0.23 m L·100 g-1)。用GC-MS检测挥发油的化学成分,建立色谱指纹图谱,结果显示当归和当归鲜品挥发油成分的差异较小,当归和当归叶挥发油成分的差异较大。对挥发性成分进行定性和定量并分析其差异性,结果显示:当归鲜品和当归有18个共有成分和7个非共有成分,共有成分在当归和当归鲜品中的相对含量大于97%;当归和当归叶有10个共有成分和46个非共有成分,共有成分在当归和当归叶中的相对含量分别为94%和34%,差异成分主要为当归叶中的烯类、醛类、酮类及长链烷烃类成分。当归、当归鲜品和当归叶中相对含量最高的挥发性化学成分均为Z-藁本内酯。 2.当归、当归鲜品及当归叶的补血功效评价及谱效关系研究采用乙酰苯肼（APH）和环磷酰胺（CTX）联合复制血虚大鼠模型,通过测定脏器指数、外周血常规以及生化指标,考察当归、当归鲜品和当归叶的补血作用。结果显示,与空白组比较,模型组的肝脏指数（LI）和脾脏指数（SI）升高,红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、白细胞（WBC）和血小板（PLT）数量下降,血液中谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶（G6PD）活性降低,促红细胞生成素（EPO）代偿性升高,差异具有显著性（P<0.05）;与模型组比较,当归给药组和当归鲜品给药组的LI和SI下降、TI上升,RBC、HGB、WBC和PLT数量上升,GR、GPX、G6PD活性升高,EPO代偿性升高,差异具有显著性（P<0.05）;当归叶给药组的SI下降,RBC、HGB、WBC数量上升,GR和GPX活性升高,差异具有显著性（P<0.05）。药效多指标综合分析结果显示,当归和当归鲜品的补血作用较好,效果接近,当归叶的补血作用较弱。通过灰色关联度分析（Gray Relational Analysis,GRA）和偏最小二乘（Partial Least Squares,PLS）回归分析建立UPLC-Q-TOF-MS色谱指纹图谱与HGB、RBC、WBC和PLT的谱效关系,结果表明:当归的补血药效成分为正离子模式下的1#、2#、6#、10#、11#、12#、23#（阿魏酸）、40#化合物和负离子模式下的3#（新绿原酸）、6#、7#（绿原酸）、10#（咖啡酸）、18#化合物。当归鲜品的补血药效成分为11#、23#（阿魏酸）、40#、48#和49#化合物。当归叶的主要补血药效成分为正离子模式下的10#、11#、13#、23#（阿魏酸）和24#化合物和负离子模式下的1#（柠檬酸）、2#、7#（绿原酸）、14#（5-O-阿魏酰奎宁酸）和26#化合物。当归、当归鲜品和当归叶的补血药效成分既有相同的成分,也有不同的成分。 3.当归、当归鲜品和当归叶干预血虚大鼠的代谢组学研究采用GC-MS代谢组学技术对灌胃给予当归、当归鲜品和当归叶的药液后血虚大鼠的血浆和脾脏的内源性代谢物进行分析,初步筛选出9个生物标志物:亚油酸、花生四烯酸、缬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸、肌醇、甘油。9个生物标志物主要参与的代谢通路有7条,分别为亚油酸代谢,甘油磷酯代谢,花生四烯酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及磷酸肌醇代谢。通过分析代谢通路可知,当归和当归叶干预的主要通路为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及亚油酸代谢,当归鲜品干预的主要通路为亚油酸和花生四烯酸代谢。将化学成分与生物标志物进行相关分析,得到与生物标志物相关系数较高的化学成分,这些成分可能为当归的补血药效成分,用于进一步质量标志物的筛选。 4.基于网络药理学预测当归、当归鲜品和当归叶补血功效的分子作用机制采用网络药理学方法预测当归、当归鲜品和当归叶治疗血虚证的分子作用机制。首先筛选当归、当归鲜品和当归叶活性成分的作用靶点,并富集相关的信号通路,通过“成分-靶点-通路”网络分析发现了7条与补血相关的信号通路,其中甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及花生四烯酸代谢这2条通路与代谢组学研究结果一致。其次筛选与血虚证相关的疾病靶点并找出与活性成分的共同靶点,通过“成分-靶点-疾病”网络分析发现HIF-1信号通路可能为当归、当归鲜品和当归叶治疗血虚证的主要信号通路。通过蛋白互作PPI网络分析筛选出关键作用蛋白,结果显示当归的关键蛋白是TLR4、STAT1和IL1B,当归鲜品的是ILIB,当归叶的是TLR4和STAT。同时筛选出关键蛋白并找出对应的化学成分,用于进一步质量标志物的筛选。 5.当归、当归鲜品和当归叶补血功效的质量标志物筛选以中药整体观研究方法为指导,将谱效关系、代谢组学、网络药理学筛选出来的补血药效成分进行整合,通过将“谱效关系-代谢组学-网络药理学”多维关联,筛选质量标志物。结果表明,阿魏酸、咖啡酸和绿原酸可以作为当归的质量标志物,阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯和49#化合物可以作为当归鲜品的质量标志物,阿魏酸、绿原酸和5-O-阿魏酰奎宁酸可以作为当归叶的质量标志物。首次发现5-O-阿魏酰奎宁酸为补血药效成分,其关键作用靶点分别为STAT3和PRKCD。本论文通过“谱效关系-代谢组学-网络药理学”多维关联体系对当归、当归鲜品和当归叶补血功效的质量标志物进行筛选,为建立当归合理的质量控制和质量评价方法提供了参考。通过比较当归、当归鲜品和当归叶的化学成分和补血功效,探讨其补血作用机制,为当归鲜品的临床应用和当归非药用部位的开发提供了一定的理论依据。

摘要译文

关键词：

当归、当归鲜品和当归叶; 补血功效; 质量标志物; 谱效关系; 代谢组学; 网络药理学

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

中药学

导师：

王亚丽

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]

D O I：

10.27026/d.cnki.ggszc.2020.000238