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胰高血糖素样肽1对心肌重塑和心功能的保护作用及机制研究认领

作者：

郑荣华

学位授予单位：

山西医科大学

摘要：

动物实验和临床观察结果证实,各种药理学手段干预抑制心脏肥大和纤维化,可以延缓心脏功能的恶化。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要生物活性肽产物,通过与其血管紧张素II 1型受体（AT1R）的结合,对心血管系统的变化、起着重要的病理生理调节作用。尽管AngII转换酶抑制剂或受体阻断剂,已常规用于临床并取得了良好的治疗效果,但病人观察的结果表明,此类药物的使用可产生一系列的副作用。因此,寻求通过调节AngⅡ系统的变化,进而减少心脏重塑并促进心脏功能恢复的辅助疗法,仍值得进一步研究。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种肠降血糖激素,体内半衰期较短,使用外源性GLP-1协同剂利拉鲁肽已广泛用于糖尿病人的治疗。近年来的研究结果表明,不依赖降血糖调节机制的利拉鲁肽疗法,也可用于高血压,心肌梗塞,心肌病和其它多种心血管疾病的治疗。但有关GLP-1疗法对压力性负荷所致心力衰竭的疗效和作用机理,尚缺少足够的系统性评价和探索。因此,本研究选择了大鼠腹主动脉缩窄在体心脏模型,观察了利拉鲁肽对由压力负荷增加所致AngII系统活化的干预特征（研究第一部分）,包括:1)心肌氧化应激和抗氧化酶的作用;2)AngII AT1/AT2受体平衡的调节;3)纤维细胞的迁移和增生的影响;4)心肌细胞肥大和心脏收缩和舒张功能的调节。为了解调节的可能机制,实验进一步分析了利拉鲁肽疗效的作用环节（研究第二部分）,包括:1)观察血液中GLP-1水平的变化;2)心脏形态和重量的作用;3)纤维化反应调节蛋白表达如mTOR/p70S6K的影响;4)自噬调节蛋白表达如LC3,Beclin-1,p62的影响;5)心肌纤维化和心功能改变的调节。在培养的H9C2心肌细胞,观察了利拉鲁肽对AngⅡ诱导下心肌细胞反应特征的直接作用（研究第三部分）,包括:1)细胞增殖和肥大的作用;2)AngII受体表达的调节;细胞氧化反应水平如ROS和纤维化介导蛋白TGFβ1和α-SMA的调定;3)纤维化调节蛋白如mTOR,p-mTOR,p70S6K,p-p70S6K表达的影响;4)胶原蛋白表达变化的作用。在上述研究中,为澄清利拉鲁肽调定AngII受体和纤维化的传导机制,实验采用AngII AT1受体阻断剂替米沙坦和mTOR特异性抑制剂雷帕霉素进行了对比性观察,证实了利拉鲁肽受体通路和氧化应激的直接细胞效应。本研究的结果表明,GLP-1疗法对压力负荷增加所致的心肌纤维化和功能紊乱,有显著的抑制作用;这种保护效应是通过调定AngII受体和纤维化反应过程来实现的。这些研究结果也为GLP-1疗法在心衰病人的治疗,提供了新的实验基础和应用前景。第一部分胰高血糖素样肽1通过阻断大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体减轻腹主动脉缩窄后的心脏重塑并改善心脏功能目的:血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）通过引起心脏重塑和功能障碍而导致心力衰竭的发生,在心力衰竭的发病机制中具有重要的作用。已证明胰高血糖素样肽1（GLP-1）对动物和患者具有心脏保护作用。本研究想证实GLP-1受体激动剂利拉鲁肽是否通过改变AngⅡ1型受体（AT1R）受体表达来抑制腹主动脉缩窄（AAC）引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）替米沙坦治疗组（Telmi组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以10mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠替米沙坦。2.定期测量大鼠体重和血糖值。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.酶标仪检测:通过丙二醛（MDA）、超氧化物歧化物（SOD）和人N端前脑钠素（NT-pro BNP）试剂盒检测大鼠心脏MDA和NT-pro BNP的含量以及SOD的活性。5.免疫组化法:定位及评估心脏组织的ACE2、巨噬细胞、肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。6.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。7.Western-blot法:测定心肌组织中AT1R、AT2R、TGF-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3、smad4、smad7、collagenI和collagenⅢ的蛋白定量表达。8.采用2D Vivid7超声仪测定大鼠的心功能。9.采用BL-410生物信号采集与处理系统:检测大鼠心率、血压及左心室血流动力学指标。结果:1.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠血糖、体重的影响:从术后第2周开始定期测量大鼠体重和血糖值,随着时间的推移,虽然两种数据均出现上升趋势,但各组同一时间的数值之间并无显著的统计学差异。2.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌肥大和HW/BW的比值的影响:腹主动脉缩窄术16周后,相对于Sham组大鼠HW/BW比值（3.38±0.17vs.2.46±0.05,p<0.05）和MSA（1512±99 vs.586±98μm2,p<0.05）明显升高,利拉鲁肽和替米沙坦可分别减少HW/BW比值（2.63±0.09和2.77±0.05vs.AAC组,所有p<0.05）和MSA降至766±61μm2或871±51μm2（与AAC组相比,p<0.05）。3.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏衰竭的影响:相对于Sham组,AAC组在实验16周后检测发现NT-pro BNP（48.4±8.6pg/ml）表达水平显着提高,给予利拉鲁肽和替米沙坦治疗后,NT-pro BNP的表达水平分别为（10.3±0.8pg/ml和14.8±1.3pg/ml vs.AAC组,所有p<0.05）。4.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏氧化应激和抗氧化酶的影响:与Sham组相比,AAC组心肌组织中的MDA表达显著提高（23.4±1.3vs.16.3±0.6nmol/mg,p<0.05）,SOD表达水平却降低（8.1±0.8 vs.10.4±0.4U/mg,p<0.05）。相对于AAC组,给予利拉鲁肽或替米沙坦药物后可使MDA水平分别降低至15.9±1.6和17.2±1.4nmol/mg（相对于AAC组,p<0.05）,且SOD酶活性分别提高至11.9±1.2和11.6±1.1U/mg（与AAC组相比,p<0.05）,结果提示给药后心脏抗氧化能力增强。5.利拉鲁肽和替米沙坦降低术后大鼠AT1R、AT2R、AT1R/AT2R比值及ACE2的影响:实验结束时,相对于Sham组,AT1R的蛋白表达水平显著提高10.55±2.5%,而AT2R的蛋白表达则降低了36.43±5.6%,p<0.05。在手术后给予利拉鲁肽和替米沙坦药物后,AT1R和AT2R的表达与AAC组呈现相反的表达水平。在抑制AT1R表达的同时刺激AT2R的表达,体现为AT1R/AT2R比例的降低。免疫组织化学染色显示,相对于Sham组,AAC组中血管周围和心肌间质中ACE2的表达显著减弱。相对于AAC组,在术后给予利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗可逆转ACE2的表达下降。6.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠巨噬细胞浸润和TGF-β1的影响:免疫组织化学法检测AAC组心脏切片结果表明,在血管周围区域和心肌间质中聚集了大量巨噬细胞,而利拉鲁肽或替米沙坦治疗可减轻这些巨噬细胞的聚集数量,Sham组则很少见巨噬细胞在心肌组织间隙中聚集。与AAC组巨噬细胞浸润增强相一致,心肌中TGF-β1的表达也显著增加。WB检测TGF-β1的蛋白质水平,进一步证实了TGF-β1表达的变化。与AAC组相比,在腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦可使心脏中巨噬细胞浸润和TGF-β1的表达均降低。7.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠肌成纤维细胞增殖和Smads蛋白的影响相对于Sham组,AAC组在心肌血管周围出现大量的α-SMA阳性肌成肌纤维细胞。而在Sham组,在心肌细胞间隙中仅有很少的α-SMA阳性细胞表达。在进行腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙坦的药物治疗,α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显减少。在Sham组中,Smad2和Smad3几乎没有被磷酸化。然而AAC组,Smad2/3的磷酸化显著增强,与Smad2/3的总蛋白水平增加相一致。相对于Sham组,AAC组中Smad4的总蛋白水平显著上调,而Smad7的总蛋白表达下调。然而,通过利拉鲁肽或替米沙坦药物治疗后明显逆转了所测Smad家族成员蛋白质表达的变化趋势。8.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心肌组织胶原蛋白合成和纤维化的影响:与Sham组相比,AAC组中胶原蛋白I和Ⅲ的蛋白水平显著增加。利拉鲁肽或替米沙坦的给药组I型和Ⅲ型胶原蛋白的产生相对AAC组显著减少。AAC组Masson结果显示由胶原蛋白面积百分比来表示的沉积胶原蛋白区域在血管周围和间质心肌中显著扩展。在整个实验中,在假手术对照中均未检测到新合成的胶原蛋白。腹主动脉缩窄术后给予利拉鲁肽或替米沙药物组,心脏中血管周区域和心内膜均显示胶原沉积显著减少。9.利拉鲁肽和替米沙坦对术后大鼠心脏功能的影响:超声结果显示相对于Sham组,AAC组在实验的16周时导致LVIDd显著增加,LVEF和LVFS降低。与AAC组的结果相比,利拉鲁肽或替米沙坦治疗可增强心脏功能。BL-410生物信号采集和处理系统结果显示:相对于Sham组,AAC组中大鼠的MAP,HR和LVEDP各项指标都显着增加,LVSP降低。此外,左室压力的最大增加速率(+dp/dtmax)和左室压力的减小速率(-dp/dtmax)明显降低。利拉鲁肽和替米沙坦治疗16周可有效预防心脏功能减退,与抑制心脏肥大和纤维化的结果相一致。结论:1.利拉鲁肽对心肌重塑和心功能具有保护作用;2.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用主要通过下调AT1R,AT1R/AT2R,上调AT2R和ACE2的表达,进而减少自由基产生有关;3.利拉鲁肽对长期压力超负荷大鼠的心脏保护作用是通过减少巨噬细胞聚集,抑制TGF-β1/Smads表达,进而减少胶原沉积和纤维化增殖有关。第二部分胰高血糖素样肽1通过抑制mTOR/p70S6K信号通路对压力超负荷引起心肌纤维化和功能障碍的保护作用目的:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）介导组织纤维化并负面调节自噬。本部分旨在研究胰高血糖素样肽1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是否通过抑制mTOR/p70S6K信号传导并促进自噬活性来保护心脏免受腹主动脉缩窄引起的心脏纤维化和功能障碍。方法:1.分组:雄性SD大鼠进行腹主动脉缩窄术（AAC）后,将大鼠随机分为四组（每组n=6）,观察16周:（1）假手术对照组（Sham组）:大鼠不进行腹主动脉缩窄的情况下进行了相同的手术;（2）腹主动脉缩窄术组（AAC组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后观察16周;（3）利拉鲁肽治疗组（Lira组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后每天两次皮下注射利拉鲁肽,剂量为每次0.3mg/kg;（4）雷帕霉素治疗组（Rapa组）:大鼠进行腹主动脉缩窄术,术后以0.2mg/kg/天的剂量通过胃管法给予大鼠雷帕霉素。2.检测大鼠血糖和血浆中GLP-1含量,利用GLP-1试剂盒酶标仪检测。3.实验结束后,取出大鼠心脏,计算心脏重量/体重比值（HW/BW）,心脏组织进行固定、包埋后,HE染色测定心肌细胞横截面积（MSA）。4.免疫组化法:定位及评估心脏组织的肌成纤维细胞（α-SMA）的表达。5.Masson三色染色法:测定大鼠心脏胶原纤维的分布。6.Western-blot法:测定心肌组织中GLP-1R、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K、p70S6K、LC3、Beclin-1、p62、collagen I和collagenⅢ的蛋白定量表达。7.无创评估大鼠心脏整体功能。8.有创大鼠血流动力学测定。

摘要译文

关键词：

AngⅡ1型受体; 心肌纤维化; 心脏功能; 利拉鲁肽; 替米沙坦; 心肌纤维化; 心脏功能; 利拉鲁肽; mTOR/p70S6K; 自噬; AngⅡ; H9C2心肌细胞; 利拉鲁肽; AngⅡ1型受体; mTOR/p70S6K

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

生理学

导师：

赵志青

中图分类号：

R54[心脏、血管（循环系）疾病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]

D O I：

10.27288/d.cnki.gsxyu.2020.000045