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代谢工程改造酿酒酵母合成花姜酮及13R-泪柏醚认领

被引量： 2

作者：

张传波

学位授予单位：

天津大学

摘要：

以酿酒酵母为底盘异源表达萜类化合物合成途径往往会影响其生理和遗传特性,如抑制细胞生长、遗传不稳定等,使得生物合成途径不能有效工作。如何平衡工程细胞生长与产物合成之间的关系是影响产物合成效率的重要问题,本论文针对此问题,以倍半萜花姜酮及二萜13R-泪柏醚（13R-MO）为研究对象,利用合成生物学技术,结合代谢工程调控策略分别从代谢模块构建、代谢模块与代谢模块之间的适配及代谢途径与工程细胞适配等层面构建了可高效合成倍半萜花姜酮及二萜13R-MO的微生物细胞工厂。花姜酮是一种倍半萜天然产物,具有抗肝癌、乳腺癌等生物活性。为了实现其在酿酒酵母中的合成,通过模拟酿酒酵母发酵葡萄糖生产代谢产物过程,调控MVA途径关键基因,建立了“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”,实现了工程细胞生长与α-蛇麻烯合成分段调控,使α-蛇麻烯的产量相较于未调控菌株提高了12.8倍,达到62.86 mg/L,进一步利用过氧化物酶体的区室化优势,将MVA途径中负责转化乙酰-Co A为FPP的8个酶及α-蛇麻烯合酶定位到过氧化物酶体,使α-蛇麻烯的产量达到160 mg/L;共表达8-羟基-α-蛇麻烯合酶CYP71BA1及来源于拟南芥的ATR1可合成113.16μg/L的8-羟基-α-蛇麻烯,进一步通过多拷贝位点表达ICE2（酿酒酵母的III型膜蛋白）,α-蛇麻烯合酶ZSS1,CYP71BA1及ATR1使8-羟基-α-蛇麻烯的产量相较于出发菌株提高了134倍达到15.2 mg/L,在此基础上多拷贝表达醇脱氢酶突变体ZSD1S114A,使工程细胞可以合成20.6 mg/L的花姜酮。13R-MO是cAMP促进剂毛喉素的重要前体,利用“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”,在优化的倍半萜合成酿酒酵母底盘中,通过一步步代谢工程策略成功使FPP代谢流流向GGPP,包括融合内源BTS1p及ERG20F96Cp,截短13R-MO合酶Cf TPS2及Cf TPS3等,构建了可高效合成二萜13R-MO的酿酒酵母底盘,使13R-MO的产量较出发菌株提高了142倍,达到328.15 mg/L。利用5-L发酵罐放大试验,使α-蛇麻烯产量相较于出发菌株提高了352.4倍达到1726.78 mg/L,使13R-MO的产量相较于出发菌株提高了1408倍达到3 g/L,同时首次实现了以微生物为底盘从头合成倍半萜花姜酮并使其最终产量达到40mg/L。本研究构建的酿酒酵母底盘细胞及开发的“基于底物浓度变化的产物合成自调控策略”可同时用于其他倍半萜、二萜甚至四萜等天然产物的合成。

摘要译文

关键词：

酿酒酵母; α-蛇麻烯; 13R-泪柏醚; 8-羟基-α-蛇麻烯; 花姜酮; 代谢工程; 合成生物学

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

制药工程

导师：

赵广荣卢文玉

中图分类号：

TQ920.1[基础理论];O629.6[芳香油化学]

学科分类号：

081703[生物化工];082202[发酵工程];083604[生物过程工程];083606[微生物发酵工程];070303[有机化学];070306[化学生物学];081704[应用化学]

D O I：

10.27356/d.cnki.gtjdu.2019.000153