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基于肠道菌群探讨鸦胆子油抗乳腺癌的作用认领

被引量： 1

作者：

陈小红

学位授予单位：

广州中医药大学

摘要：

乳腺癌是女性最常见的癌症,截止至2017年,乳腺癌仍然是我国女性患者的发病首位（17.07%）。针对乳腺癌的临床治疗手段有手术治疗、内分泌治疗、放疗、化疗及靶向治疗等,但术后肿瘤转移、耐药性、毒副作用、费用高昂等问题仍然困扰广大患者。因此,寻找疗效更优、安全系数更高的乳腺癌治疗药物（手段）一直是乳腺癌研究的重点。鸦胆子为苦木科（Simaroubaceae）鸦胆子属（Brucea J.F.Miller）植物鸦胆子(Bruceajavanica（Linnaeus）Merrill)的干燥成熟果实,是治疗恶性肿瘤的常用中药。经石油醚或正己烷提取得到的鸦胆子油（Brucea javanica oil,BO）是鸦胆子的主要药效部位,生产中将鸦胆子油经乳化作用制成的水包油型乳剂获得鸦胆子油乳,是鸦胆子最常见的上市中药制剂,临床上用于肿瘤的辅助性治疗。多数研究人员认为油酸、亚油酸等脂肪酸成分即为鸦胆子油的抗肿瘤药效物质,尽管已有研究报道,油酸、亚油酸对肿瘤细胞生长有一定的抑制作用,但就构成和比例而言,鸦胆子油与常见食用油（如橄榄油、核桃油等）无显著差异[1]。以上说明,鸦胆子油的抗肿瘤物质基础有待深入研究。鸦胆子油乳在临床上主要用于肺癌、肺癌脑转移及消化道肿瘤的治疗。而其在对抗乳腺癌的研究却未曾报道。在前期试验中我们发现,鸦胆子油对乳腺癌细胞（MDA-MB-231）几乎无直接的细胞毒作用,但动物实验结果却表明口服鸦胆子油表现出明显的抗乳腺癌（MDA-MB-231）作用,以上结果均提示鸦胆子油须通过口服给药才能发挥抗乳腺癌作用。近年来,越来越多研究发现,肠道菌群（Gut microbiota）不仅与肿瘤发生发展密切相关,更对肿瘤治疗的新型药物和手段发挥疗效产生重要影响。肠道菌群不仅是口服给药后药物的首要作用对象,也是影响药效的重要因素。因此本论文将从肠道菌群角度探讨鸦胆子油发挥抗乳腺癌活性的机理。目的:本课题基于全微生物组关联分析（Microbiome/Metagenome-wide association studies,MWAS）的方法探讨鸦胆子油抗乳腺癌的作用机理,为鸦胆子油的二次开发和应用提供参考依据。方法:1.鸦胆子油的体外抗乳腺癌作用观察通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT)法检测鸦胆子油对人乳腺癌细胞MDA-MB-231活力的干预影响,并以紫杉醇（Paclitaxel,PTX）和橄榄油为对照。另外,同时设立四个单体成分（油酸、亚油酸、棕榈酸以及棕榈油酸）为对照,以评价脂肪酸类成分对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖影响。2.鸦胆子油干预乳腺癌移植瘤生长的作用观察在体内研究中,取BALB/c裸小鼠,通过皮下注射MDA-MB-231细胞（2×106/只）建立裸鼠三阴性乳腺癌移植瘤模型,灌胃给予鸦胆子油30天（BO低、中、高剂量组:BOL、BOM、BOH,对应剂量为100,200,400 mg/kg）。期间观察并记录小鼠的肿瘤体积,同时收集小鼠粪便。实验结束,采用颈椎脱臼法处死小鼠,收集血清、盲肠内容物,剖取结肠、肝脏、肾脏、肿瘤等,用于后续实验。灌胃给予BALB/c裸小鼠含四种抗生素（甲硝唑、硫酸新霉素、盐酸万古霉素、氨苄青霉素钠）的无菌水,构建伪无菌动物模型,灌胃给予鸦胆子油（400mg/kg）。同时在小鼠无菌隔离器外设立对照组。期间观察并记录小鼠的肿瘤体积大小。实验结束后,采用颈椎脱臼法处死小鼠,剖取肿瘤称重并进行比较。苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,H&E）观测结肠、肝脏、肾脏以及肿瘤组织形态,评价并比较鸦胆子油和紫杉醇对动物结肠、肝脏以及肾脏组织的影响,以及观察肿瘤组织形态。蛋白印迹法（Western Blotting,WB）测定自噬蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、ULK1的水平,并采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）检测LC3、Beclin-1以及ATG 5等的基因表达水平,阐述鸦胆子油抗人乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用机制。3.荷瘤动物肠道微生物的宏基因组分析通过全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun,WGS）对模型组和给药组小鼠盲肠内容物中的微生物进行测序分析,从门、纲、目、科、属、种等不同层次进行比较两组微生物的结构及相对丰度差异,并对微生物群落功能基因进行注释,最终找出关键差异微生物以及代谢通路。4.荷瘤动物血清、粪便代谢物的代谢组分析采用非靶向代谢组学分析方法,应用超高效液相Q ExactiveTM Focus组合型四极杆Orbitrap rM质谱联用技术检测样品中的代谢物,使用多维统计分析方法主成分分析（principal components analysis,PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal to partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）进行模式识别并获取投射中变量重要性（variable importance in the projection,VIP）大于1的值,并结合单维统计分析寻找差异代谢物,探讨经鸦胆子油治疗对荷瘤小鼠引起的代谢变化情况。结果:1.鸦胆子油的体外抗乳腺癌作用观察MTT实验结果显示,鸦胆子油（0.156～40 μg/mL）对MDA-MB-231细胞的活力无影响。阳性药紫杉醇的IC50为16.39 ng/mL,抑制作用显著。已有文献报道,鸦胆子油对白血病细胞U937、人肝癌细胞SMMC-7721等癌细胞的IC50为10～20 μg/mL,因此上述结果提示鸦胆子油在体外对MDA-MB-231几乎无直接的细胞毒作用。值得注意的是,与之对照的橄榄油给药组以及脂肪酸单体成分（油酸、亚油酸、棕榈酸以及棕榈油酸）对MDA-MB-231细胞也无直接细胞毒作用。2.鸦胆子油对乳腺癌移植瘤的作用观察动物实验结果显示,相比于模型组,鸦胆子油给药组及紫杉醇给药组的肿瘤体积及重量显著降低,橄榄油给药组几乎无差异。伪无菌动物实验结果显示,肠道菌群被破坏后,鸦胆子油给药组与模型组的肿瘤重量无差异。而正常SPF环境下,鸦胆子油可显著的抑制肿瘤的生长,以上均表明鸦胆子油可抑制三阴性乳腺癌的生长,其作用与肠道菌群关系密切。HE染色观察结果表明,紫杉醇给药组的小鼠结肠绒毛结构破坏严重,绒毛长度缩短,排列稀疏,而鸦胆子油给药组绒毛结构完整,接近模型组;相比模型组及鸦胆子油给药组,紫杉醇给药组小鼠的肝脏出现明显的炎性浸润。肿瘤组织的HE观察结果显示,相比模型组,鸦胆子油给药组及紫杉醇给药组出现了大面积的细胞坏死区域。提示鸦胆子油在抑制肿瘤功效方面以及在治疗中对非目标器官的安全性具有良好的应用潜质。WB以及RT-qPCR的检测结果显示,鸦胆子油灌胃给药后降低了肿瘤组织的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、ULK1的蛋白表达水平,下调LC3、Beclin-1以及ATG 5的基因表达。以上结果提示,鸦胆子油在活体实验中有明显的抗乳腺癌活性;并且相对于阳性药紫杉醇的副作用少;鸦胆子油发挥抗乳腺癌作用的机制可能与抑制肿瘤细胞的自噬有关。3.鸦胆子油对荷瘤动物肠道微生物的宏基因组分析宏基因组测序结果显示,鸦胆子油可以提高荷瘤动物的肠道菌群α-多样性和改变了肠道菌群的β-多样性。物种分类学的分析发现,属水平上,鸦胆子油可以提高Ndongobacter、Acidaminococcus、Heliobacterium,降低 Streptococcus、Mordavella 的相对丰度。种水平上,鸦胆子油可以提高Acidaminococcusintestini、Heliobacteriummodesticaldum、Ndongobactermassiliensis、unidentifiedphage、Bacteroidesdorei、CandidatusMelainabacteriabacteriumMELA1,降低MordavellaspMarseilleP3756、Streptococcuspyogenes、Enterococcuscecorum、Streptococcussuis的相对丰度。差异代谢通路分析表明,鸦胆子油干预后主要影响氨基酸的代谢以及糖的合成与代谢,并使糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases,GHs）基因水平显著升高,而使糖基转移酶（Glycosyl Transferases,GTs）显著下降。上述结果提示,鸦胆子油的抗乳腺癌作用可能与其调节肠道微生物的种类构成及代谢功能密切相关。4.鸦胆子油对荷瘤动物血清、粪便代谢物的代谢组分析对模型组以及鸦胆子油给药组的血清代谢组分析结果显示,两组血清样品的代谢物整体轮廓有差异,并筛选及鉴定出10种差异代谢物（苯乙酰甘氨酸、苏氨酸、哌啶酸、DL-赖氨酸等）。对模型组以及鸦胆子油给药组的粪便代谢组分析结果显示,两组粪便样品的代谢物整体轮廓有差异,并筛选及鉴定出12种差异代谢物（L-焦谷氨酸、L-正亮氨酸、异亮氨酸、γ-氨基丁酸等）。血清代谢组与宏基因组的关联性分析显示,肠氨基酸球菌（Acidaminococcus intestini）与苯乙酰甘氨酸（Phenylacetylglycine）、哌啶酸（Pipecolic acid）、DL-赖氨酸（DL-Lysine）、尿酸（Urocanic acid）高度正相关。代谢组分析结果表明,鸦胆子油可显著干预宿主体内的氨基酸代谢状态,其作用与肠道菌群差异物种密切相关。结论:体外实验结果表明,鸦胆子油对MDA-MB-231细胞无直接细胞毒作用。动物实验结果发现,鸦胆子油具有抑制MDA-MB-231细胞所形成的肿瘤的作用,且其副作用较小,以上结果提示鸦胆子油抗乳腺癌的作用与肠道菌群密切相关。其作用机制可能是通过改变肠道菌群中与氨基酸的合成及代谢相关的菌的丰度,影响肠道菌群的氨基酸代谢功能。同时,鸦胆子油可使MDA-MB-231细胞所形成的肿瘤组织自噬水平显著下降。上述结果提示鸦胆子油抗乳腺癌的作用可能与影响肠道菌群的氨基酸代谢功能、调控机体的氨基酸水平以及抑制肿瘤的自噬有关。本论文研究发现鸦胆子油在乳腺癌治疗中具有重要的潜在应用价值,可为其在乳腺癌治疗中的二次开发提供新思路。

摘要译文

关键词：

鸦胆子油; 乳腺癌; 自噬; 肠道菌群; 宏基因组学; 代谢组学

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

中药学

导师：

赖小平

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27044/d.cnki.ggzzu.2020.000873