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含有6-脱氧甘露庚糖的两种细菌荚膜多糖相关寡糖类似物的合成研究认领

被引量： 1

作者：

耿雪韵

学位授予单位：

山东大学

摘要：

研究发现,细菌表面普遍表达大量多糖分子,如荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)等,它们不仅参与细胞分化、繁殖、衰老等过程,还是细菌攻击宿主的基础物质,并与毒性和侵染性密不可分,因而具有重要的生物学意义。细菌多糖一般在结构上高度保守且具有一定的免疫原性,这些特性使其成为研制亚单位疫苗的理想靶标抗原之一。然而,多糖只能诱导B细胞参与的免疫反应,并没有免疫记忆;但它与载体蛋白共价链接形成糖缀合物后,可激发T细胞依赖的免疫应答,接种后可长效保护机体。目前,市场上已有多种基于多糖、寡糖设计的细菌糖缀合物疫苗,如B型流感嗜血杆菌疫苗、A+C群脑膜炎球菌疫苗和肺炎链球菌疫苗等。这些糖缀合疫苗的成功研制激发了科研工作者对细菌多糖的研究热情。近年来,随着检测技术和生物学科的飞速发展,人们对多种人类致病菌的CPS或LPS的结构解析和免疫学活性研究也逐步深入。科学家们发现细菌细胞表面多糖的重复单元中,除含有常见六个碳及以下的低碳糖外,还有多种以7～9个碳原子为骨架的高碳糖,其中庚糖就是含有七个碳原子的高碳单糖。细菌庚糖一般以庚醛糖为主,分为6-位脱氧或甘油(非脱氧)两种类型,并有吡喃和呋喃两种环状结构。研究发现多种庚糖相关的寡糖抗原在动物实验中表现出强烈的免疫原性和保护作用,有的已经进入临床试验阶段。这些研究结果都证明含有庚糖结构的多糖和寡糖的蛋白缀合物可作为候选疫苗,具有很好的发展前景。那些在细胞表层多糖中检测到各种庚糖的细菌多数是人类致病菌,例如曾用作细菌武器的类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)和鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)以及表面CPS中分布多种罕见的庚糖变体的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)等。类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌是一类革兰氏阴性菌,具有易获取、易扩散、对抗生素天然耐药等特性,而且对人体各个器官都会攻击,临床诊断困难且致死率较高,这些条件使其具备用作细菌武器的潜在危险。美国疾病控制预防中心(CDC)将这两种细菌列为B类生物恐怖制剂和Ⅰ级病原微生物。而空肠弯曲菌是引起肠炎性腹泻最常见的食源性致病菌之一,在发展中国家传播率较高,患者除呕吐、肠胃炎等消化道疾病外还有患神经肌肉麻痹疾病格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome,GBS)等后遗症的可能,导致面神经麻痹和运动神经瘫痪等,疾病负担严重。然而,目前市场上并没有控制和预防这两类细菌的有效疫苗。研究发现类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌的CPS都以β-2-O-乙酰-6-脱氧-甘露庚糖结构作为重复单元,不仅是其毒力的决定性因素,还是一种保护性抗原。而分布多种庚糖变体的空肠弯曲菌的CPS不仅是血清抗性和侵染肠上皮细胞的物质基础,其结构差异还是细菌Penner血清系统的分型依据。基于以上研究,科研工作者利用CPS的免疫原性设计疫苗,以便有效地控制这两类细菌的感染问题。目前,获得多糖抗原的一般方法是从破碎细菌中直接分离提取,但这种途径得到的多糖存在结构不均一且混杂类毒素等有害物质等缺点。化学合成法可以制备结构明确均一的寡糖抗原,不仅可有效地解决疫苗的质量和安全问题,糖链长度和特殊修饰的自由合成,还可以用以构效关系的深入研究。基于此,我们选择以6-脱氧-甘露庚糖为基础的类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌CPS以及空肠弯曲菌HS53血清型RM1221毒株CPS为研究对象,开展相关寡糖类似物的合成和免疫学研究工作。根据两种CPS的结构特征,我们设计了以6-脱氧-甘露庚糖为单糖模块的多个寡糖片段,这些结构中有的存在多个难制备的β-(1→3)键,有的还含有α-(1→3)键和α-(1→3)连接的磷酸二酯键。通过文献调研和多种不同策略或路线的尝试,最终以较短的路线和较高的收率立体选择性地完成了一系列寡糖半抗原的化学合成工作。其中,类鼻疽或鼻疽伯克霍尔德菌CPS寡糖片段还与载体蛋白无毒性白喉毒素变异体(CRM197)缀合得到寡糖蛋白缀合物候选疫苗,并对其活性进行了初步测试。本论文主要包括以下三个部分:一、对细菌中常见庚醛糖的种类、来源和一般合成方法做了详细的综述;此外,还介绍了类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌及空肠弯曲菌CPS的结构和研究现状。最为常见的庚糖是C-6位非脱氧的一对差向异构体,常以α吡喃构型的支链三糖形式分布于多种高致病性革兰氏阴性菌的脂多糖内核心区域。此外,外核心区域和O-抗原重复单元也偶有发现。第二处聚集多种C-6-脱氧/非脱氧庚糖的区域是空肠弯曲菌表面CPS。合成庚醛糖的一般策略有己糖的一碳延伸法、戊糖的二碳延伸法、从头合成法和几种其它方式。以常见低碳糖为手性源的碳链延伸包括亲核加成、亲核取代、烷基锂盐、格氏加成、Wittig反应、金属参与等方法。另外,也有将从头合成普通葡萄糖法应用到合成庚糖上的途径,但这类研究报道较少。二、类鼻疽和鼻疽伯克霍尔德菌CPS相关寡聚体类似物及蛋白缀合物的合成和免疫活性初步评价。该CPS仅以β-(1→3)连接的顺式6-脱氧-甘露庚糖作为重复单元,且2-O-位被乙酰基(Ac)修饰。据此,我们设计了八个目标分子,分别是含有Ac和不含Ac的单糖、二糖、三糖和四糖,用于免疫原性的构效关系研究。庚糖的合成直接从D-甘露糖出发,选择一碳延伸策略中简便的Wittig反应一步构建出6,7-庚糖烯,再对双键反马氏加成完成6-脱氧-甘露庚糖单体的制备。在单糖模块的组装过程中,我们尝试了三种方式:分子内糖苷配基转移策略(IAD)、直接偶联和氢键诱导糖苷配基转移策略(HAD)。IAD策略对实验无水条件要求较高,并不适合本研究中存在多个顺式构型甘露庚糖寡聚体的大量合成。而直接糖苷化虽然可以以41%的收率得到β产物,但是后续的分离纯化却耗时费力。最后,3-O-位Pico(吡啶-2-甲酰基)介导的糖基受体定向转移的HAD策略,可以成功实现β-(1→3)顺式甘露糖寡聚体单糖、二糖、三糖和四糖的高效构建。HAD途径操作简单且立体选择好,更重要的是Pico脱除后不仅可以作为受体,催化氢化又能直接生成目标分子中四个无Ac的寡糖。我们以双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)为交联剂实现了八个寡糖与无毒性白喉毒素变异体CRM197和牛血清蛋白(BSA)之间的缀合。并采用基质辅助激光解吸飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪确定了缀合前后的蛋白分子量,利用其差值计算出载糖量。初步免疫结果表明,八个寡糖CRM197缀合物都可以诱导较高水平的kappa和IgG抗体,其中IgG代表了抗体类型的转变和T细胞依赖免疫应答的发生;而两组有无Ac修饰的寡糖缀合物所诱导的抗体水平并没有显著性差异,这表明Ac基团对免疫结果和趋势影响较小。此外,对比不同聚合度的寡糖抗原,两个三糖缀合物表现出最强的免疫原性,说明较长糖链并不一定具有更好的抗原性。三、空肠弯曲菌HS53血清型RM1221菌株CPS三糖片段及其二聚体类似物的合成。与类鼻疽菌CPS相似,空肠弯曲菌CPS也以相同的6-脱氧-甘露庚糖作为唯一糖残基;不同的是,除了 β-(1→3)顺式糖苷键外,其重复三糖片段中还存在一个α-(1→3)键和α-(1→3)磷酸二酯键。最初我们计划收敛的[2+1]和[3+3]方式合成糖链;α、β和磷酸二酯键的构建分别利用邻基效应、HAD和H-膦酸酯策略完成,而庚糖依旧通过Wittig联合反马氏加成法制备。但在HAD策略介导的偶联反应中,我们意外发现Pico与3-OH受体之间的氢键受邻位2-O-Bz的影响,与其呈竞争关系,这大大降低Pico的诱导顺式糖苷键的功能。经多个糖苷反应探索,我们发现受体2-O-位引入酰类的保护基对选择性影响很大,且Bz>Ac,这可能是2-O-酯羰基与3-OH形成了环内氢键,使Pico诱导效应丧失所致。之后我们应用醚类的Nap和Bn保护基团可获得较高选择性,侧面印证了我们的结论。为了解决以上2-O-酯羰基导致的氢键竞争问题,我们重新设计了糖链的组装路线,将[2+1]调整为[1+2],先利用2-O-酰基的邻基效应构建反式α键,再将2-O-酰基替换为无效应的醚类保护基,高效且立体选择地完成目标三糖的合成。最后,经H-膦酸酯法完成[3+3]的汇聚组装,成功合成目标六糖中的α-(1→3)磷酸二酯键。两个目标化合物的还原端都引入了游离氨基,为后续糖缀合物的制备和生物学实验研究提供了便利。

摘要译文

关键词：

鼻疽伯克霍尔德菌; 类鼻疽伯克霍尔德菌; 空肠弯曲菌; 庚糖; 荚膜多糖; 化学合成; 碳水化合物; 糖缀合疫苗

学位年度：

2020

学位类型：

博士

学科专业：

有机化学

导师：

郭忠武顾国锋

中图分类号：

TQ464[生物制品药物的生产]

学科分类号：

081702[化学工艺];083611[医药生物工程];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2020.006963