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血清型3型肺炎链球菌相关寡糖蛋白缀合物的免疫活性研究及一种新型糖结合疫苗载体的构建认领

作者：

冯少杰

学位授予单位：

山东大学

摘要：

据 WHO 统计,下呼吸道感染(lower respiratory tract infections,LRTIs)是全球最致命的传染性疾病,在全世界每年约造成300万人的死亡。肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,Spn)作为最常见的可造成LRTIs的致病菌之一,受到人们的广泛重视。Spn主要感染儿童、老人和免疫力低下人群,可引起脑膜炎、肺炎和菌血症等致死性疾病。目前对Spn感染的治疗主要以抗生素为主,但越来越多的耐药Spn菌株的出现,使得抗生素治疗效果下降,而疫苗作为一种有效的预防Spn感染的手段再次受到人们的重视。目前,商业化的Spn疫苗分为多糖疫苗(PPV)和多糖结合疫苗(PCV)两类,这些疫苗的广泛使用有效地降低了Spn感染的发病率。尽管如此,疫苗本身仍有诸多不足,例如血清型受限、血清型3型Spus pneumoniae serotype 3,ST3)免疫应答较低,以及糖结合疫苗的广泛使用可能造成的载体介导的表位抑制(carrierinducedepitopic suppression,CIES)效应等等。为解决现有疫苗对ST3免疫应答较低的问题,PeterH.Seeberger等以ST3荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)的重复二糖单元为基础构建了二、三和四糖等寡糖片段,并以此进行了一系列构效关系评价。虽然这些研究取得了一定的成果,但并未找出ST3CPS的最优寡糖抗原表位。此外,前人还以Spn的特异性蛋白为抗原,构建了各种不同的蛋白疫苗,希望借此克服糖疫苗血清型受限和血清型转换等问题,但多数蛋白疫苗在人体实验中效用欠佳,蛋白疫苗候选物还需进一步探索。围绕上述现有ST3疫苗免疫应答较弱和血清型受限等问题,本论文主要进行了以下三方面研究。第一,为研究ST3 CPS的最佳寡糖抗原表位,本实验室前期工作中合成了基于ST3 CPS二糖重复单元的五糖1a、六糖1b、七糖1c和八糖1d片段,并以此构建了四种寡糖-TT缀合物2a-d。本论文研究首先对合成的寡糖缀合物2a-d进行了一系列免疫学评价。(1)以TT缀合物2a-d免疫小鼠后发现,缀合物2a-d均可引起较强的免疫应答,且五糖缀合物2a和六糖缀合物2b诱导的特异性IgG1 抗体滴度(2a:27,023.50±6,496.11,2b:37,831.10±6,254.27)要显著高于七糖缀合物 2c 和八糖缀合物 2d (2c:7,691.97±3,185.01,2d:5,367.44 ±1,001.55),这表明缀合物2a和2b的免疫原性要显著强于缀合物2c和2d。(2)对六糖缀合物2b进一步分析发现,免疫次数和佐剂对其免疫原性无显著影响,而连接臂对其免疫原性有一定影响。通过对这些影响因素的研究,可得出缀合物2a-d诱导的免疫应答为寡糖特异性的,免疫应答强度较高且受各种因素的影响较小。(3)通过分析缀合物2a-d免疫组抗血清对所有四个寡糖的交叉识别,我们发现各个缀合物诱导产生的抗体均可识别所有四个寡糖1a-d,且同一缀合物抗血清对各个寡糖半抗原的识别强度几乎无差别,这表明缀合物2a-d诱导产生的抗体极有可能识别一个类似的寡糖表位。(4)以流式细胞术进一步分析发现,六糖缀合物2b免疫组抗血清对ST3的识别要显著强于其它三个缀合物。此外,体外OPA实验同样表明缀合物2b免疫组介导的对ST3的调理吞噬作用最强。这些结果均表明六糖缀合物2b免疫组小鼠产生的功能抗体的水平要显著高于其它三个缀合物。(5) ST3攻毒实验表明,六糖缀合物2b免疫的小鼠对ST3的清除、肺组织炎症和存活率均有极其显著改善。这些结果均意味着六糖缀合物2b可非常有效地保护小鼠免受ST3的感染。(6)通过对CD4+T细胞早期活化的标志分子CD69的分析,我们发现TT缀合物2b可激活六糖特异性的CD4+T细胞。进一步对这些活化的CD4+T细胞分析发现,BSA缀合物3b刺激后其IL-4表达水平上调,而IL-4是Th2类细胞分泌的特征分子。由此我们推断,六糖缀合物2b可激活六糖特异性的CD4+T细胞,并诱导这些CD4+T细胞分化为Th2类细胞,从而促进特异性抗体亚型的转换和增强体液免疫应答。第二,本论文以Spn的抗原蛋白Ply、PspA和PsaA为基础,构建了具有广谱保护作用的融合蛋白YAPO和YAPL。(1)通过对PsaA和Ply蛋白晶体结构的分析,我们设计并纯化了 PsaA蛋白和无毒性的rsPly蛋白;通过对PspA蛋白保护性抗体识别位点的分析,我们设计并纯化了 rsPspA蛋白。免疫结果表明rsPly、rsPspA和PsaA均可诱导小鼠产生较强的特异性免疫应答,且小鼠产生的特异性抗体可识别血清型3、4、5、6B、15B、19A和23F Spn,从而表明rsPly、rsPspA和PsaA诱导小鼠产生的抗体可分别对Spn表面天然状态的Ply、PspA和PsaA蛋白有较好的识别。(2)为获得对各血清型Spn均有较好识别的抗原蛋白,我们设计并纯化了基于rsPly、rsPspA和PsaA的融合蛋白YAPO和YAPL。免疫小鼠后发现,YAPO和YAPL诱导小鼠产生的免疫应答要显著强于rsPly、rsPspA或PsaA蛋白单独免疫时,且产生的抗体对野生型Ply、PspA和PsaA蛋白有很好的识别。(3)进一步分析发现,YAPO和YAPL免疫后小鼠产生的抗体可识别血清型3、4、5、6B、15B、19A和23F Spn,这表明YAPO和YAPL诱导小鼠产生的抗体可很好的识别Spn表面天然状态的Ply、PspA和PsaA蛋白。体外OPA实验证实,YAPO和YAPL免疫后小鼠产生的特异性抗体能有效介导对ST3、ST6B、ST19A和ST23F的调理吞噬作用。(4) ST3和ST6B的攻毒实验表明,YAPO和YAPL能在Spn感染小鼠时有效提高小鼠的存活率。上述一系列的结果均表明YAPO和YAPL对小鼠具有很好的保护作用,初步符合我们所期望的糖蛋白疫苗的载体的要求。第三,为获得血清型覆盖更广的PCV疫苗以及减少CIES效应发生的可能性,本论文对YAPO和YAPL蛋白作为PCV的同种属来源蛋白载体的潜能进行了评价。(1)将YAPO和YAPL重组蛋白与五糖1a进行缀合,构建了五糖-YAPO缀合物5a和五糖-YAPL缀合物5b。(2)缀合物5a-b免疫后,小鼠产生的特异性识别五糖半抗原的 IgG 抗体水平(5a:28,175.68±17,281.63,5b:11,585.53±3,378.47)与五糖-TT缀合物2a (20,208.39±5,253.82)无显著差异,且小鼠对载体蛋白YAPO和YAPL的免疫应答并未受到寡糖缀合的影响。此外,与缀合物2a诱导的特异性识别五糖的抗体主要为IgG1亚型不同,缀合物5a-b诱导的特异性识别五糖的抗体主要为IgG1和IgG2b以及少量的IgG2a。与IgG1抗体相比,IgG2b和IgG2a具有更高的Fc受体亲和力,能够更高效的介导调理吞噬作用。上述结果表明YAPO和YAPL蛋白作为糖缀合物蛋白载体是切实可行的,它们可高效的增强寡糖特异性的免疫应答,且对寡糖免疫应答的促进作用要优于TT蛋白。(3)进一步分析发现,缀合物5a-b免疫组抗血清不仅对ST3的识别能力远高于缀合物2b,还对血清型4、5、6B、15B、19A和23F Spn有较好的识别。此外,OPA实验同样证实缀合物5a-b不仅能保护小鼠免受ST3的感染,还能保护小鼠在一定程度上不受血清型6B、19A和23F Spn的感染。这表明缀合物5a-b不仅可预防缀合物血清型Spn的感染,还可预防非缀合物血清型Spn的感染。(4) ST3和ST6B攻毒实验表明,缀合物5a免疫的小鼠对ST3和ST6B的清除、肺组织炎症和存活率均有极显著改善,而TT缀合物2a仅在ST3感染时对小鼠有保护作用。这表明YAPO载体可使寡糖缀合物的保护作用覆盖非缀合物血清型Spn。由上述结果我们可以得出,YAPO或YAPL蛋白作为Spn糖结合疫苗载体蛋白要优于TT蛋白,且以这两种蛋白为载体的糖缀合物能为小鼠提供缀合物血清型之外的保护作用。综上所述,本论文围绕PCV13中ST3免疫应答较弱、血清型受限和CIES效应等问题,开展了对ST3 CPS的寡糖片段免疫保护作用以及对源自Spn的重组蛋白作为糖结合疫苗的载体蛋白的研究。本论文研究的意义在于:(1)评价了ST3荚膜寡糖片段缀合物2a-d的免疫活性,丰富了对ST3荚膜寡糖片段的免疫构效关系的研究;(2)鉴定了六糖1b可能为ST3 CPS免疫保护作用最好的寡糖表位,并确证了其六糖缀合物可诱导T细胞依赖的体液免疫应答,这为后续新型ST3的糖疫苗的研发提供了理论基础;(3)构建了融合重组蛋白YAPO和YAPL,并证实了 YAPO和YAPL作为Spn糖结合疫苗的载体蛋白要优于TT,为PCV的研发提供了一种新型载体;(4)构建了一种新型的ST3寡糖疫苗,推进了后续PCV新型多组分疫苗的研发。

摘要译文

关键词：

血清型3肺炎链球菌; 荚膜多糖; 寡糖缀合物; Ply; PspA; PsaA; YAPO; YAPL; 结合疫苗蛋白载体; 疫苗; 免疫保护作用

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

郭忠武顾国锋

中图分类号：

R39233;R392-33[免疫学技术、设备及实验方法]

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2019.001070