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蛋氨酸脑啡肽通过阿片受体调节CD8+ T细胞活性机理的研究认领

被引量： 1

作者：

焦雪

学位授予单位：

中国医科大学

摘要：

目的:体外实验主要研究MENK通过调控阿片受体亚基对CD8+ T细胞功能的影响。体内实验主要研究MENK对C57BL/6荷瘤小鼠脾中CD8+ T细胞转录组的影响,以及对lncRNA及mRNA的差异基因表达的影响,并对差异表达基因进行富集分析,找出MENK调控CD8+ T细胞的信号通路。研究方法:1.体外实验采用阴性富集法分离纯化C57BL/6小鼠脾脏CD8+ T细胞,在RNA和蛋白水平分别采用real-time PCR和western blot检测MENK对CD8+ T细胞的MOR和DOR表达的影响。在MENK的作用剂量上我们选择了0、10-77 M、10-88 M、10-99 M、10-1010 M、10-1111 M。为了阻断μ受体的表达,我们选择了μ受体选择性阻断剂CTAP进行后续实验,分别采用0、4.5μM、450 nM、45 nM、4.5 nM对活化的CD8+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了阻断δ受体的表达,我们采用δ受体选择性阻断剂NTI进行后续实验,分别采用0、10μM、1μM、100 nM、10 nM对活化的CD8+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了同时阻断μ和δ受体,我们选择了非选择性阿片受体拮抗剂NTX体外阻断CD8+ T细胞的阿片受体表达,分别采用0、13μM、1.3μM、130 nM、13 nM对活化的CD8+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了研究不同阿片受体对CD8+ T细胞表型和功能的影响,我们采用流式细胞术对CD8+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB、Prf进行了检测。为了研究MENK对CD8+ T细胞增殖的影响,我们采用阴性富集法对细胞进行分离纯化,进行CFSE染色后加入CD3、CD28抗体激活刺激,药物分组为对照组、MENK组、CTAP+MENK组、NTI+MENK组、NTX+MENK组,各组均加药培养3天,然后采用流式细胞术检测细胞的增殖。2.采用C57BL/6 S180肉瘤荷瘤小鼠模型研究MENK体内对S180肉瘤的抗肿瘤作用及脾中CD8+ T细胞转录组的影响。采用磁珠分选法阴性富集MENK治疗组及对照组小鼠脾中的CD8+ T细胞,采用高通量RNA转录组测序分析MENK对纯化后各组中CD8+ T细胞lncRNA及mRNA的影响。采用Cuffdiff软件对拼接后的转录本进行差异表达分析,使用基于负二项分布的模型,筛选条件为P-adjust<0.05。采用GOseq R包对差异表达基因的mRNA和lncRNA靶基因进行GO（基因本体）富集分析,筛选条件为校正后的P value小于0.05具有统计学差异,GO显著富集。采用KOBAS软件对本次测序中预测的差异表达mRNA和lncRNA进行KEGG信号通路富集。为了进一步验证差异表达基因,我们选择KEGG中富集的具有显著性差异的信号通路进行real-time PCR实验验证,主要验证的靶基因为cell cycle（P=0.005）通路中的CCnd3、Cdc7、Anapc4、Smc3、Atm;P53 pathway（P=0.007）中的Pten、Atr、Casp8、Ccnd3、Atm;Ras pathway（P=0.028）中的Rasgrp2、Pak2、Bad、Ets-1、Rap1b、Rala、Tbk1、Rasa3;Neurotrophin signaling pathway（P=0.005）中的Kidins220、Rap1b、Matk、Prkcd、Camk2b、Bad、Rps6ka3;经典阿片受体MOR、DOR。主要验证的差异表达lncRNA为GM27008、Snhg6、Tug1和Pvt1。结果:1.MENK在体外可以促进CD8+ T细胞中阿片受体的表达,在RNA水平上,MENK可以促进MOR和DOR的表达,最佳的作用浓度是10-1010 M,在此作用浓度相对于对照组MOR的表达量为2.03±0.21,DOR的相对表达量为1.89±0.45,差异有统计学意义（P<0.05）。CTAP处理后能够显著下调MOR的RNA和蛋白表达水平,各实验浓度的相对蛋白表达量依次为1.13±0.02、0.62±0.01、0.85±0.01、0.62±0.05、0.63±0.01,差异有统计学意义（P<0.05）。在RNA水平NTI能够显著抑制DOR的表达,同时上调MOR的表达（P<0.01）。在1μM作用下,DOR的相对表达显著下调,其对应的相对表达量为0.75±0.04,而MOR的相对表达出现上调,其对应的相对表达量为2.88±0.37,差异有统计学意义（P<0.01）。蛋白的实验结果与RNA水平相互验证,在1μM作用下,DOR的蛋白表达显著下调,蛋白条带相对于内参的相对表达量为0.56±0.02,MOR的蛋白条带相对于内参的表达量为1.09±0.05。在RNA水平NTX能够同时显著抑制MOR和DOR的表达,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.28±0.01,DOR相对于β-actin的表达量为0.35±0.03（P<0.01）。在蛋白水平表达结果与RNA水平趋势一致,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.44±0.02,DOR相对于β-actin的表达量为0.51±0.03（P<0.01）。MENK处理组CD8+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB表达显著上升（P<0.01）,选择性阻断MOR（CTAP+MENK）或DOR（NTI+MENK）后上述指标表达水平显著下降,而同时阻断MOR和DOR（NTX+MENK）后CD28、PD-1、CTLA-4、Fas L和GrzB的表达水平进一步下降。MENK处理组可显著增强CD8+ T细胞的增殖（P<0.01）;单纯阻断MOR（CTAP+MENK）或DOR（NTI+MENK）后不能阻断MENK对CD8+ T细胞的增殖作用,同时阻断MOR和DOR后,MENK对CD8+ T细胞的增殖作用消失。2.MENK治疗对S180肉瘤具有显著的抗肿瘤作用。对实验组和对照组脾中CD8+ T细胞进行转录组测序后,基于转录组拼接结果,经过严格筛选,共预测得到845个不具有编码潜能的lncRNA。我们对差异表达的lncRNA、TUCP及mRNA进行了后续的聚类分析和GO及KEGG富集分析。MENK组相对于对照组差异表达的lncRNA有8个上调基因,5个下调基因;差异表达的TUCP有3个上调基因,7个下调基因;差异表达的mRNA有301个上调基因,240个下调基因。差异lncRNA靶基因GO富集分析结果主要为GO:0005251（delayed rectifier potassium channel activity）,GO:0008076（voltage-gated potassium channel complex）,GO:0034705（potassium channel complex）,GO:0005249（voltage-gated potassium channel activity）,GO:0034702（ion channel complex）,GO:0043269（regulation of ion transport）;差异mRNA GO富集分析结果主要为GO:0005634（nucleus）,GO:0044260（Cellular macromolecule metabolic process）,GO:0044428（nuclear part）,GO:0005622（intracellular）,GO:0031981（nuclear lumen）,GO:0044237（Cellular metabolic process）。差异表达lncRNA靶基因KEGG富集分析结果主要为Thyroid cancer（Mmu05216）,Cholinergic synapse（Mmu04725）,Bladder cancer（Mmu05219）,Fox O signaling pathway（Mmu04068）,Endometrial cancer（Mmu05213）,Acute myeloid leukemia（Mmu05221）;差异表达mRNA靶基因KEGG富集分析结果为Ribosome（Mmu03010）,Viral carcinogenesis（Mmu05203）,Amphetamine addiction（Mmu05031）,P53 signaling pathway（Mmu04115）,Neurotrophin signaling pathway（Mmu04722）,Alzheimer’s disease（Mmu05010）。通过Real-time PCR对预测的差异表达基因进行实验验证,证实具有统计学意义的差异表达mRNA为bcl-2、Bax、Rap1b、Pak2、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2、MOR、DOR,其中表达上调的mRNA为:bcl-2、Pak2、MOR、DOR,表达下调的mRNA为:Bax、Rap1b、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2;差异表达的lncRNA为GM27008和Pvt1,并且经过实验验证GM27008和Pvt1的RNA相对表达均为显著上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.MENK通过上调μ和δ阿片受体调控CD8+ T细胞的增殖和功能表型;MENK对CD8+ T细胞的调控作用可以在μ或δ单独或同时被阻断时消失;MNEK可能通过调控阿片受体的联合亚基发挥重要的免疫调节功能。2.MENK对S180肉瘤具有显著的抗肿瘤效果;MENK治疗可提高荷瘤鼠脾和淋巴结中CD8+ T细胞的比例。MENK治疗能够显著影响荷瘤鼠脾中CD8+ T细胞转录组中mRNA及lncRNA的表达。

摘要译文

关键词：

蛋氨酸脑啡肽; CD8+ T细胞; 阿片受体; 免疫调节; 转录组学; RNA测序

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

免疫学

导师：

单风平

中图分类号：

R392[医学免疫学]

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学]

D O I：

10.27652/d.cnki.gzyku.2019.000253