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小刺猴头菌发酵浸膏多糖和寡糖的分离纯化及对RAW264.7细胞氧化损伤的保护作用认领

被引量： 8

作者：

任桂红

学位授予单位：

吉林农业大学

摘要：

小刺猴头菌是一种珍贵的食药用真菌,其工厂化生产采用液体深层发酵技术,以发酵液浓缩后的发酵浸膏入药,用于治疗萎缩性胃炎、消化性溃疡等胃肠疾病。研究表明,多糖和寡糖是小刺猴头菌发酵浸膏重要活性成分,关于其抗炎、抗肿瘤、调节肠道菌群等活性有较多的研究报道,但是对其抗氧化活性尤其是细胞水平抗氧化活性的研究还比较少,而慢性炎症、溃疡、肿瘤等疾病的发生和发展与细胞氧化还原平衡出现紊乱有关。因此,本试验对小刺猴头菌发酵浸膏多糖和寡糖进行分离和纯化,分析其化学性质,并对化学抗氧化和细胞抗氧化活性进行研究,以明确其抗氧化活性组分及其作用机制,为相关产品的开发和应用提供参考。本研究采用乙醇沉淀、膜透析以及柱层析方法对不同分子量多糖和寡糖进行分离和纯化。通过测定还原糖、可溶性蛋白、糖醛酸、硫酸基和氨基糖含量对其化学组成进行分析,采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法和FI-TR分析单糖组成和结构。采用化学反应体系对主要多糖和寡糖组分的抗氧化能力进行检测,筛选出具有抗氧化活性的含糖组分;再建立H2O2氧化损伤的RAW264.7巨噬细胞模型,检测细胞活力、抗氧化酶活性、细胞MDA和ROS水平,以及细胞凋亡率,进一步确定各组分对细胞氧化损伤的保护作用。采用q-PCR法检测对抗氧化酶基因转录的影响,利用Western-Blot分析检测对信号蛋白MAPK和Nrf2的激活情况,初步明确其抗氧化损伤的分子机制。主要结果如下:（1）获得了4种粗糖组分:d-HFCO1（500 Da以下）、d-HFCO2（500-5,000 Da）、d-HFCP1（5000-50,000 Da）、d-HFCP2（50,000 Da以上）,以及13种纯化后的组分,其中有2种高纯度的中性寡糖d-HFCO1-1和d-HFCO2-1（总糖含量88.90%和97.43%）和1种较高纯度的中性多糖d-HFCP1-1（总糖含量55.43%）。（2）HFCO还原糖含量较高,蛋白质主要存在于HFCP中,粗糖各组分均含有少量的糖醛酸、氨基糖和硫酸基。单糖组成均以Glc为主,随着分子量增大,单糖种类增多,Gal比例增大。d-HFCO1-1、d-HFCO2-1具有α和β两种糖苷键,d-HFCP1-1以β-糖苷键为主。（3）ABTS和DPPH自由基清除能力为:d-HFCP150值由小到大的顺序为:d-HFCO150值,d-HFCP1-150值均超出试验浓度范围。（4）d-HFCO2和d-HFCP1均可显著提高细胞活力,降低MDA水平,提高T-SOD、GPx和CAT的活性（p<0.05）;2种中性糖组分可显著提高细胞活力,降低MDA水平（p<0.05）,d-HFCO2-1显著提高CAT的活性,d-HFCP1-1显著提高T-SOD和CAT活性（p<0.05）。d-HFCO2-1和d-HFCP1-1都能抑制ROS的产生,减少细胞的死亡和凋亡。（5）d-HFCO2-1和d-HFCP1-1均能显著提高Mn-SOD、GPx1和CAT的mRNA的相对含量（p<0.05）,促进三种抗氧化酶的基因转录。d-HFCP1-1的活性高于d-HFCO2-1,与其促进抗氧化酶活性的趋势一致。（6）d-HFCP1-1处理促进了Nrf2蛋白与Keap1的解离,以及Nrf2的核移位,在1.5h时即可达到显著性水平（p<0.05）。结论:（1）HFC含糖组分以中性糖为主,含少量酸性糖,寡糖含量较高。（2）HFCO和HFCP可以通过清除自由基、提高抗氧化酶活性、抑制MDA和ROS的产生、降低细胞的凋亡率,对H2O2氧化损伤的RAW264.7细胞起到保护作用,多糖的效果优于寡糖,粗糖的效果优于中性糖。（3）HFCO和HFCP的抗氧化作用可能与其降低MAPK蛋白的磷酸化水平、促进Nrf2的核移位有关。综上所述,本研究明确了小刺猴头菌发酵浸膏多糖和寡糖中抗氧化活性的主要组分,初步揭示了其抗氧化机制,为小刺猴头菌的合理开发利用提供了理论依据。

摘要译文

关键词：

小刺猴头菌发酵浸膏; 多糖; 寡糖; 抗氧化; MAPK; Nrf2

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

作物生物技术

导师：

宋慧

中图分类号：

TQ281[碳水化合物、糖];TS201.4[食品营养学]

学科分类号：

081702[化学工艺];0822[轻工技术与工程];083201[食品科学];083205[食品营养]