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基于hT2Rs的中药苦味物质基础发现及其味效关系研究认领

被引量： 1

作者：

张宇昕

学位授予单位：

北京中医药大学

摘要：

建立符合现代科学认知的中药药性理论科学内涵阐释方法是中药药性理论研究的关键问题之一。中药药性理论对中药性质描述的模糊性、药性本身的多样性和复杂性等难题制约了中药在药性理论指导下的新药开发和国际认同度。中药药性理论作为描述中药系统性特征以及作用人体后体现的多种功能之理论,揭示其化学及生物学物质基础并明确与中药药性的相关性是阐释其科学内涵行之有效的研究思路与方法。中药功效是多种药性元素组合后的功能体现,目前基于单一因素的中药药性理论的化学及生物学基础研究往往忽略了中药药性本身的系统性和整体性,无法切实阐述中药药性的物质基础和科学内涵。本文立足中药“五味”理论,关注科学发展前沿,将“人苦味受体(即Ⅱ型味觉受体)在除口腔外组织中表达并介导生理功能活性”的最新发现与苦味药性理论相结合,在激活苦味受体中药有效成分评价基础上绘制不同苦味受体亚型的靶标活性谱,建立苦味受体亚型及整体与中药药性及药性组合之间的关联关系,实现以不同药性组合为分类标准对苦味药性科学内涵进行细致阐释的目的。此外,本文通过研究苦味受体与药理作用的相同物质基础,验证了该方法的科学性与适应性。研究方法: 1.建立苦味受体的高通量筛选模型并评价其可靠性建立苦味受体不同亚型的过表达细胞株,评价已知苦味激动剂激活苦味受体的量效关系。利用Spiking及Z因子评价方法,对所建立的苦味受体过表达细胞株进行高通量筛选模型评价,确保高通量筛选的可靠性。 2.利用高通量筛选模型对中药化学成分进行苦味受体激动效应评价在苦味受体高通量筛选模型的基础上,评价中药化学成分对苦味受体的激动效应,绘制苦味受体靶标活性谱,分析不同苦味受体亚型所命中的化合物结构类型。模拟苦味受体的蛋白三级结构,评价蛋白结构合理性,利用分子对接方法研究苦味受体与中药有效成分的结合位点与结合模式。 3.利用关联指数构建苦味受体与药性及药性组合的关联关系以高通量筛选中来源于《中国药典》(2015版)的中药指标性成分为研究对象,研究苦味受体与中药药性的关联关系。通过统计高通量筛选中来源于《中国药典》(2015版)的中药指标性成分总数(T),激活某种苦味受体亚型的中药成分个数(K),来源于具有某一药性特征中药的中药成分个数(G),以及同时作用于该苦味受体亚型与来源于该药性特征中药的中药成分个数(B),利用关联指数M公式计算苦味受体与药性及药性组合之间的关联度。利用药性组合所对应的药理作用与苦味受体现代生理功能进行文献对比验证,说明关联关系的可靠性。 4.评价具有抗凝血活性的中药有效成分以验证苦味“味效关系”的可靠性为进一步验证不同苦味受体亚型与药性组合“味效关系”的可靠性,本文评价了具有抗凝血活性的中药有效成分,通过分析与激活苦味受体相同的化学物质基础,验证苦味受体与药性组合的关联关系。首先构建基于药效团和分子对接的凝血酶抑制剂虚拟筛选模型,对中药化学成分进行虚拟筛选,对潜在的活性成分进行体外凝血酶抑制作用评价,并建立化合物抑制凝血酶的量效关系曲线。利用表面等离子共振技术,进一步验证活性成分与凝血酶之间的直接相互作用,分析其结合解离的相互作用关系。在细胞层面上,评价中药有效成分在体外对血小板聚集的抑制作用。本部分将从结构-分子-蛋白-细胞等不同层面评价中药有效成分的抗凝血作用。 5.评价具有抗过敏活性中药有效成分以验证苦味“味效关系”的可靠性本文评价了具有抗过敏活性的中药有效成分。构建基于药效团和分子对接的脾酪氨酸激酶抑制剂虚拟筛选模型,对中药化学成分进行虚拟筛选。对具有潜在抑制活性的中药化合物进行体外脾酪氨酸激酶抑制活性评价,建立量效关系曲线。在细胞层面上,评价中药化合物在体外对肥大细胞脱颗粒的抑制作用,研究化合物作用于肥大细胞后对脾酪氨酸激酶的磷酸化程度。本部分同样在结构-分子-蛋白-细胞等不同层面评价了中药化学成分的抗过敏作用。研究结果: 1.本文成功构建了 13种不同苦味受体亚型的高通量筛选模型,分别是hT2R1、hT2R4、hT2R7、hT2R10、hT2R14、hT2R38、hT2R39、hT2R40、hT2R43、hT2R44、hT2R46、hT2R47 及 hT2R49。 2.本文通过高通量筛选,在排除非特异性激动剂及毒性成分后,建立了中药有效成分激活不同苦味受体的靶标活性谱,发现激活苦味受体家族的中药成分多为苷类,其次是黄酮类成分、生物碱类成分以及萜类成分,苯丙素类成分及其它类成分所占比例较少。 3.通过对高通量筛选中来源于《中国药典》(2015版)的中药指标性成分进行整理和分析,本文建立了苦味受体亚型与中药药性及药性组合之间的关联关系,发现苦味受体家族与药性四气中的寒性(M=1.40),与药性五味中的苦味(M=1.35)、涩味(M=1.06)具有较强的相关性,基本与中药苦味药性理论的传统认知相一致。苦味受体与归脾、胃经(M=1.39)具有较强相关性,与苦味受体在人体中的生理分布相一致。此外,本文建立了不同苦味受体亚型与药性组合之间的关联关系,发现“寒-苦-肝”药性组合与hT2R7(M=2.24)等亚型具有相关性,发现“寒-苦-心”药性组合与hT2R43(M=2.78)等亚型具有相关性,“寒-苦-肺”药性组合与hT2R46(M=3.66)等亚型具有相关性等等。 4.为验证与苦味受体相关的药性组合及其味效关系,本文评价了与“寒-苦-心”、“寒-苦-肝”等药性组合相关的中药有效成分抗凝血药理作用。研究结果发现小檗碱、没食子酸、焦性没食子酸和川芎嗪能直接抑制凝血酶活性,其IC50值分别为4.09 μM、9.07μM、17.65 μM和9.83 μM。利用表面等离子共振技术发现小檗碱可以与阿加曲班竞争性结合凝血酶的相同位点,且在体外表现出对血小板聚集的抑制作用。此外,本文评价了与“寒-苦-肺”、“温-苦-肺”等药性组合相关的中药有效成分抗过敏药理作用。研究结果发现二氢丹参酮、丹参酮、WD7、WD10、WD21、WD17对脾酪氨酸激酶具有抑制作用,其 IC50 值分别为 0.81 μM、2.00 μM、5.69 μM,7.85 μM,2.67 μM 和 1.74 μM。槲皮素、山奈酚、WD7、WD10和WD21对肥大细胞脱颗粒可以产生抑制作用,其IC50值分别为 9.03 μM、4.98μM、5.58 μM、1.62 μM 和 0.25 μM。本文同时发现 hT2R14 拮抗剂可以拮抗槲皮素对肥大细胞脱颗粒的抑制作用,在一定程度上说明了槲皮素激活hT2R14后可以干预肥大细胞脱颗粒过程,而WD10抑制肥大细胞脱颗粒活性则与抑制Syk蛋白磷酸化作用相关。 5.结合苦味受体激动剂的高通量筛选结果及药性组合相关的药理作用评价,本文总结得到以下验证结果:小檗碱对hT2R38、hT2R40、hT2R47、hT2R49,没食子酸对hT2R7、hT2R47,川芎嗪对hT2R39的激活作用最为明显,并表现出抗凝血药理作用活性,与这些苦味受体亚型关联“寒-苦-肝”等药性组合结果相一致;槲皮素、山奈酚对hT2R4、hT2R14、hT2R43、hT2R47、hT2R49等苦味受体有较强的激活作用,并表现出抗过敏药理作用活性,与hT2R4、hT2R14关联“温-苦-肺”、hT2R43、hT2R47、hT2R49关联“寒-苦-肺”等药性组合结果相一致。综上所述,本文在明确苦味中药的化学及生物学物质基础上,研究了苦味受体及所命中中药成分的来源中药(口尝苦味的化学及生物学物质基础)与药性之间的关联关系,一方面为阐释苦味“味效关系”具有统一性提供了科学依据,一方面考察了该研究方法与思路的可靠性,为中药药性理论的研究提供了方法学支持。创新点: 1.本文用客观量化指标建立了苦味受体的靶标活性谱,并发现了与不同苦味受体亚型相关的药性及药性组合,建立了以苦味受体为核心的中药药性及药性组合现代科学内涵研究模式。 2.本文发现了同时作用于与苦味“口尝味”相关的人苦味受体及具有苦味“功能味”活性的中药有效成分,在分子及细胞水平上评价了有效成分的生物活性及作用机制,为研究苦味“味效关系”科学内涵提供了化学及生物学物质基础。

摘要译文

关键词：

Ⅱ型味觉受体; 高通量筛选; 苦味受体靶标活性谱; 味效关系; 中药药性理论

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

中药分析学

导师：

乔延江

中图分类号：

R285.1[中药药性学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.26973/d.cnki.gbjzu.2019.000269