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全基因组关联分析法鉴定与扬州鹅产蛋性状相关的候选基因及遗传变异认领

被引量： 1

作者：

Murtada Abd Alaziz Alsiddig Alamin

学位授予单位：

南京农业大学

摘要：

中国是世界拥有鹅数量最多的国家,大约有29个品种。中国本土品种是天然的基因库,也是杂交优势与种质创新的良好素材。中国鹅的繁殖季节产蛋可达100个蛋,平均为50-60个。与鸡相比,鹅生殖期较短,产蛋率差。产蛋性能的改善是家禽养殖业非常重要的动力,特别是鹅。由于鹅繁殖遗传力较低,产蛋性能差,因此选用标记辅助选择（MAS）策略尤其重要。目前鹅的基因组尚未完成,并且可获得的鹅的基因数据也少于鸡的,这限制了鹅的产蛋性状遗传标记的挖掘。单核苷酸多态性（SNPs）在基因组上的广泛分布,通过聚焦感兴趣的遗传序列能够容易地对染色体上大量的遗传变异位点进行评价,并且可以实现短时间和低成本。在本研究中,我们利用Paired-End及Illumina HiSeq2000测序方法对鹅的基因组进行测序。对来自江苏立华畜牧养殖场的492只扬州鹅中的20只鹅（分别是高产蛋组和低产蛋组各10只）进行了基因组扫描。Paired-End和Illumina HiSeq2000测序结果经生物信息学分析后共得到了 6210243个SNP位点,高产蛋组和低产蛋组中分别得到了 2968709个和3241534个。去除共有的SNP后,高产蛋组和低产蛋组分别是877787个和1150612个。最后,在过滤假阳性SNP后总共鉴定出40841个独特的SNP。通过基因功能注释,其中575个SNPs参与了动物繁殖性状,包括277个基因。通过筛选导致氨基酸序列发生变化或位于关键调节区（包括5'和3'UTR区）的SNP,总共鉴定了 24个候选SNP。选择在高产蛋组及低产蛋组等位基因频率差异显著的候选SNPs,最终确定了四个候选基因(褪黑激素受体1A（MTNR1A）contig373759,表皮生长因子受体（EGFR）contig66634,精子粘附分子1（SPAM1）contig78894 和内皮素 B 受体（ENDBR）contig320681。1、扬州鹅褪黑激素受体1A基因多态与产蛋性状及其mRNA表达的相关在本研究中,褪黑激素受体1A基因（MTNR1A）被鉴定为影响扬州鹅产蛋性状的候选基因。对共210只鹅的血样进行采集并且分析了其褪黑激素受体1A基因多态与产蛋数的关联分析。利用直接测序方法,在MTNR1A基因g.177G>C（Genbank-Accession no-ss1985399687）的5'调节区域中检测到了一个单核苷酸多态性（SNP）。鉴定了两个等位基因（G和C）和三个基因型GG,GC和CC,并且它们的基因型频率分别为0.62、0.28和0.10。此外,统计分析显示MTNR1A基因的多态与34周产蛋期间的产蛋数存在显著相关。进一步地,具有GG基因型的鹅其产蛋数（73.01 ± 1.52）显著高于CC基因型的鹅（61.63±2.90）。实时定量PCR（qRT-PCR）分析显示,MTNR1A基因在小肠、颗粒细胞和卵巢中大量表达,而在下丘脑和胸肌中表达水平较低。比较高、低产蛋组（每组10只鹅）卵巢MTNR1A基因mRNA丰度发现,高产蛋组mRNA水平较高（P<0.05）。此外,GG基因型鹅卵巢MTNR1A的mRNA表达水平（1.13±0.27）显著高于CC基因型（0.72±0.17）。启动子活性分析试验发现,以GG型启动子序列构建pGL3荧光素酶重组载体（pGL3-314G）在HEK293T和颗粒细胞中具有更强的荧光素酶活性,与对照组和CC型启动子重组载体（pGL3-314C）相比,分别增加了 64.73%和37.3%（P<0.01）。这些结果表明,MTNR1A基因中鉴定的SNP可能影响扬州鹅产蛋量及其mRNA表达水平,可以在鹅的育种中,特别是鹅产蛋性能选育中提供有价值的分子标记。2、表皮生长因子受体基因3,-UTR区单核苷酸多态与扬州鹅产蛋性状的相关表皮生长因子受体（EGFR）基因在脊椎动物和无脊椎动物的细胞交流和增殖中起关键的作用。利用直接测序法在EGFR基因的3'-UTR区域鉴定了一个核苷酸多态c.*7750 G>A。212只扬州鹅在此位点分为三个基因型（GG,GA和AA）,并且它们的基因型频率分别为0.23,0.52和0.25。此外,GG基因型的序列与NCBI中的（Ansercygnoides）的原始序列相同（XM013197419.1）,定义为野生型。关联分析结果表明,c.*7750 G>A的SNP能够显著影响鹅34周产蛋期的产蛋量（P<0.01）。GG基因型的鹅（72.31±21.72）与AA基因型（62.88±24.50）相比能够显著产生更多的蛋。实时定量PCR表明,鹅EGFR基因mRNA丰度在肾和颗粒细胞较高,在不同阶段的卵泡颗粒细胞中存在表达差异,在大白卵泡中高表达。比较不同基因型鹅卵巢中EGFR的mRNA表达水平发现,GG基因型（1.11±0.16）鹅表达水平显著高于AA基因型（0.31±0.16）。此外,利用生物信息学预测到c.*7750 G>ASNP的等位基因A引入了两个miRNA结合位点（dme-miR-5-3p和has-miR-1248）。荧光素酶活性测定显示,与阴性对照（NC）和等位基因G（P<0.05）相比,在颗粒细胞和Hela细胞中dme-miR-5-3p可以显著降低等位基因A的荧光素酶活性。上述结果表明,EGFR基因3'-UTR中的c.*7750 G>A可能是影响扬州鹅产蛋性能的功能性SNP。3、精子粘附分子1（SPAM1）基因单核苷酸多态（SNPs）与扬州鹅产蛋性状的相关精子粘附分子1（SPAM1）基因在受精中起重要的作用。它也是鹅孵化能力的一个重要候选基因。在本研究中,我们首次研究了 SPAM1基因的遗传变异及表达水平与扬州鹅产蛋性状的关联。利用直接测序技术,我们检测到了三个单核苷酸多态,包括g206 G>C,c123 T>A和c159T>C,它们位于启动子区和外显子1。在250只扬州鹅样本中,试验得到了六个等位基因（G,C,T,A,T和C）并且基因频率分别是 0.33,0.67,0.71,0.29,0.38 和 0.62,以及九个基因型（GG,CC,TT,TA,AA,TT,TC和CC）。各个SNP基因型与总产蛋数的关联分析发现,在g206G>C位点,GG组34周的产蛋数显著高于GC和CC基因型组,分别是（72.59±18.56,71.57±16.41 和 81.00±08.51）(P<0.05)。在 c123 A>T 位点,与 TA 和 TT 个体（72.51±18.37和70.94±16.34）相比,具有AA基因型的鹅显著产生更多的蛋（82.00±08.57）。在 SNPcl59T>C位点,具有 CC基因型的鹅（69.19±16.04）比具有TC或TT基因型（73.99±17.03和76.76±12.91）的鹅产蛋数显著减少。实时定量PCR分析显示,与其它组织相比,SPAM 1基因在输卵管、腹部脂肪、卵巢和小肠中高度表达。此外,输卵管和卵巢中SPAM1的mRNA表达水平:与低产蛋组（1.01±0.07、1.05±0.09）相比,高产蛋组的表达水平（0.76±0.04、0.69±0.10）显著降低;与CC基因型鹅（1.27±0.19、1.11±0.06）相比,GG基因型鹅（0.72±0.02、0.93±0.02）表达水平显著下降。采用启动子活性分析技术检测启动子区g206 G>C变异对转录活性的影响,结果发现,GG或CC基因型启动子序列构建的荧光素酶表达载体（pGL3-328G和pGL3-333C）转导扬州卵巢颗粒细胞后荧光素酶活性存在显著差异,pGL3-328G和pGL3-333C具有比pGL3-basic载体更高且显著的荧光素酶活性,pGL3-333C的荧光素酶活性比pGL3-328G显著增加了 48%（P<0.01）。4、内皮素B型受体基因内含子单核苷酸多态与扬州鹅产蛋性状的相关本研究的主要目的是确定内皮素B型受体（ENDRB）基因的单核苷酸多态性（SNP）以及评价该基因多态用作鹅产蛋性状候选分子标记的可行性。随机收集230个扬州鹅血样,DNA提取后利用特殊引物扩增了 ENDRB基因内含子1的560 bp序列。对PCR产物进行测序并且通过与基因库ENDRB参考序列（NW013185812.1）比较获得SNP。试验检测到5个SNPs,分别为g.336C

摘要译文

关键词：

鹅; 基因组测序; SNP; 重测序; MTNR1A; EGFR; SPAM1; ENDBR; 产蛋性能; 标记辅助选择

学位年度：

2017

学位类型：

博士

学科专业：

动物遗传育种与繁殖

导师：

刘红林

中图分类号：

S835[鹅⑨]

学科分类号：

0905[畜牧学]