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杨桃根提取物DMDD通过TLR4/TGFβ信号通路改善糖尿病肾病的机制研究认领

被引量： 3

作者：

张宏亮

学位授予单位：

广西医科大学

摘要：

背景:糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）发病率高,危害性大,积极探索DKD的作用靶点及治疗药物意义重大。我们的前期研究发现,杨桃根提取物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮（DMDD）有改善糖尿病肾病的作用,但其作用机制不明。目的:本论文旨在研究DMDD对TLR4/TGFβ信号通路及相关蛋白表达的影响,探索DMDD防治DKD的作用机制。方法:1、体内实验:采用高糖高脂饲料联合低剂量链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导的野生型小鼠及TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠为体内模型。野生型小鼠和TLR4-/-小鼠分别随机分为6组:空白对照组（NC）、模型组（DM）、阳性对照组（GQ）和DMDD高、中、低剂量组。空白对照组给予蒸馏水灌胃,其余各组均给予高糖高脂饲料。高糖高脂干预4周后,单次110mg/kg腹腔注射STZ复制2型糖尿病模型。造模成功后,阳性对照组在高糖高脂饲料基础上给予格列喹酮(10mg/kg·d-1)。DMDD高中低剂量组则在高糖高脂饲料基础上分别给予50、25和12.5mg/kg·d-1的DMDD。连续给药4周后,处死小鼠,测定一般指标及肾功能的变化。HE染色观察肾脏组织病理学改变,Masson染色观察纤维化情况的变化,透射电镜观察肾小管形态及纤维化情况的变化。免疫组化检测TLR4、BAMBI、TGFβ1、Smad2/3的表达水平,RT-PCR和Western-blot检测TLR4、BAMBI、TGFβ1、Smad2/3的mRNA和蛋白表达的变化。2、体外实验:以人肾小管上皮细胞（HK-2）为体外模型,采用高糖（60mmol/L葡萄糖）刺激HK-2细胞转分化。CCK8法确定DMDD的给药剂量,然后观察不同剂量DMDD对HK-2细胞转分化的影响。免疫荧光法、RT-PCR和Western-blot法检测TLR4和TGFβ/Smad信号通路的基因及蛋白表达的变化。进一步,通过慢病毒转染过表达及沉默BAMBI蛋白,RT-PCR和Western-blot检测TLR4和Smad2/3以及转分化相关指标E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白表达的变化。结果:1、体内实验（1）高糖高脂联合STZ刺激可导致小鼠糖尿病肾病的发生,DMDD可以降低糖尿病小鼠的血糖和血脂,同时也可以改善胰岛素抵抗以及糖耐量和胰岛素耐量情况。（2）胱抑素C（CysC）和微量尿蛋白水平可以作为肾功能损害的敏感标志物,DMDD干预后可明显改善DKD小鼠的CysC和微量尿蛋白水平。（3）HE染色结果显示,在野生型小鼠中,糖尿病模型小鼠肾小球明显增大,基底膜异常增厚,间质出现炎症浸润以及纤维化,DMDD干预后,肾小球体积缩小明显,基底膜亦变薄,浸润的炎症及纤维化现象亦逐步减少,且病理改善随DMDD的剂量呈正相关变化。在TLR4-/-小鼠中,糖尿病模型组的病理改变程度较野生型同组比明显减轻,DMDD干预后,病理改变亦呈好转趋势。Masson染色结果显示,糖尿病组小鼠肾脏组织胶原沉积明显增加,DMDD干预后肾脏纤维病理改变明显减轻,而阳性对照组未发现明显的改善。与野生型小鼠相比,TLR4-/-小鼠的纤维化程度明显减轻。透射电镜显示,模型组肾间质成分明显增多,出现了较多的胶原纤维。当给予DMDD干预后,高中低各组的肾间质成分均明显减少,胶原纤维亦出现下降。阳性对照药物格列喹酮则无此效果。在TLR4-/-模型小鼠中,没有出现明显的纤维化。（4）免疫组化的结果显示,在野生型小鼠中,高糖高脂饮食与STZ刺激可使TLR4的表达明显增加,而给予DMDD干预后,TLR4的表达呈下降的趋势,且有剂量依赖性。在TLR4-/-小鼠中,没有检测到TLR4的表达,高糖高脂及STZ刺激亦没有增加TLR4的表达。TGFβ1在野生模型组中的表达明显升高,当给予DMDD治疗后,TGFβ1表达呈进行性下降,且有剂量依赖性。当TLR4基因敲除后,模型组的TGFβ1蛋白表达量与野生型同组比明显减少。Smad2/3作为TGFβ1调控的下游蛋白,其免疫组化结果表现与TGFβ1保持相同的趋势。与TGFβ1和Smad2/3相比,BAMBI的免疫组化结果呈现相反的趋势。无论是在野生型或TLR4基因敲除型小鼠中,空白对照组均有BAMBI蛋白表达出现,当给予高糖高脂和STZ刺激后,模型组小鼠BAMBI蛋白表达量均明显降低。DMDD干预后,各组的BAMBI表达均呈上升趋势,且呈剂量依赖性。作为阳性对照药物,格列喹酮对于以上几个蛋白在肾组织中的表达的变化几无影响,提示格列喹酮对糖尿病肾病的纤维化没有保护作用。（5）RT-PCR和Western-blot结果显示,TLR4-/-小鼠没有出现TLR4mRNA及蛋白的表达。而野生型小鼠中,模型组的TLR4 mRNA和蛋白表达均明显升高,当给予DMDD干预后,TLR4表达水平均下降,且呈剂量依赖性。BAMBI的mRNA和蛋白表达在TLR4-/-小鼠中各组之间无明显差异,而在野生型小鼠中,当给予高糖高脂联合STZ刺激后BAMBI的mRNA和蛋白表达水平均明显降低;再给予DMDD干预,各组的BAMBI又呈现不同程度的上升,中、高剂量组更明显。TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白表达表现出相似的趋势,在TLR4基因敲除型小鼠中,模型组的TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白均无明显改变,DMDD干预亦未见明显变化。在野生型小鼠中,模型组的TGFβ1、Smad2/3的mRNA和蛋白表达均明显升高,再予DMDD干预后,TGFβ1和Smad2/3的mRNA和蛋白均呈下降趋势,且呈剂量依赖性。阳性对照药格列喹酮对于上述相关蛋白的mRNA和蛋白的表达没有明显的影响,提示格列喹酮保护糖尿病肾病的作用机制与TLR4-TGFβ-Smad2/3信号通路无关。2、体外实验（1）CCK8确定DMDD对HK-2细胞的IC50值为80μmol/L,据此浓度进行实验,确定DMDD的高中低剂量浓度分别为:40、20和10μmol/L。（2）高糖刺激HK-2细胞后,其形态没有发生明显的变化。划痕实验显示上皮细胞运动迁徙能力增强,表现出纤维细胞的特性,提示高糖的存在使细胞发生了EMT。此外RT-PCR和Western-blot结果显示,在高糖刺激下EMT指标E-cadherin表达下降,而Vimentin表达升高,提示上皮细胞发生了转分化。当给予DMDD干预后,E-cadherin相对表达量明显升高,而Vimentin则明显降低。（3）免疫荧光结果显示,高糖刺激后HK-2细胞的TLR4和pSmad2/3表达明显升高,而BAMBI则表达降低。经DMDD的干预后,TLR4表达出现明显下调。（4）当加入TLR4阻断剂TAK-242抑制TLR4的功能后,RT-PCR和Western-blot结果显示,高糖诱导HK-2细胞中的E-cadherin表达增多,而Vimentin则呈下降趋势。（5）过表达BAMBI后,HK-2细胞EMT程度明显降低;沉默BAMBI后,EMT增强。沉默后再用高糖刺激以及DMDD干预,EMT无明显变化。（6）作为BAMBI的下游调控蛋白,Smad2/3的表达水平与BAMBI呈负相关。过表达BAMBI,Smad2/3的表达下调;当BAMBI沉默后,Smad2/3的mRNA及蛋白表达相应上调,此时继续使用高糖刺激以及DMDD干预,Smad2/3表达无明显变化。结论:（1）DMDD具有改善糖尿病肾病小鼠肾功能的作用。（2）DMDD可明显减少糖尿病肾病小鼠TLR4及TGFβ-Smad2/3的蛋白表达。（3）TLR4与TGFβ-Smad2/3信号通路之间通过BAMBI存在信号交叉。（4）DMDD通过调控TLR4-TGFβ/Smad2/3信号通路来减缓EMT的发生从而改善糖尿病肾病。

摘要译文

关键词：

DMDD; 糖尿病肾病; Toll样受体4; 转化生长因子β; 上皮间质转分化

学位年度：

2019

学位类型：

博士

学科专业：

药理学

导师：

黄仁彬

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]