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性激素结合球蛋白对妊娠期糖尿病胰岛素传导通路相关因子的表达影响认领

作者：

冯冲

学位授予单位：

中国医科大学

摘要：

目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)定义为“妊娠期间发生或被首次识别的任何程度的葡萄糖不耐受。”日前,美国糖尿病协会(ADA)将妊娠期糖尿病重新定义为:“在妊娠第二、三期诊断的糖尿病”。其发病率在世界范围内与肥胖,II型糖尿病一起正逐年增高。我国采用IADPSG诊断标准,GDM发病率近20%,妊娠期糖尿病已成为孕期最常见的并发症之一。Waters PM[1]等人的研究发现,根据IADPSG诊断标准,GDM患者新生儿的出生体重更高、体脂率及脐C肽(cord C-peptide)更高,孕妇的剖宫产率及子痫前期的发病率更高。妊娠期糖尿病为妊娠带来致命性或非致命性的不良结局。胰岛素抵抗是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常,表现为外周组织尤其是肝脏、脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多。随着妊娠的进行,胎盘生乳素(HPL),催乳素(PRL),糖皮质激素,孕激素,胎盘生长素等均能拮抗胰岛素,胎盘又可分泌胰岛素酶,加速胰岛素降解,由此造成的胰岛素抵抗状态是妊娠期糖尿病的病理生理基础。目前认为性激素结合球蛋白(SHBG)也在妊娠期糖尿病胰岛素抵抗中起重要调节作用,是妊娠期糖尿病的独立危险因素。于已妊娠育龄妇女中,SHBG水平与GDM的严重程度负相关。SHBG为我们进一步了解GDM胰岛素抵抗的发病机制及展开妊娠期糖尿病个体化治疗提供了一种新的依据。本研究选取与产生胰岛素抵抗相关的PI3K/AKT通路,分析胎盘中SHBG与此通路的代表性因子的相关性,探究其可能作用靶点;并构造细胞水平的胰岛素抵抗模型,采用Real-time PCR和Western Blot的方法验证了SHBG及PI3K/AKT通路相关因子的表达;最后瞬时转染胰岛素抵抗模型细胞,观察SHBG的表达对胰岛素抵抗模型的增殖、凋亡、胰岛素抵抗及PI3K/AKT通路相关因子表达的影响,从而进一步了解SHBG的生物学功能,探讨SHBG在妊娠期糖尿病胰岛素抵抗信号转导通路中可能的作用机制,为未来SHBG对妊娠期糖尿病的治疗,提供依据。研究方法:1、采用Real-PCR和Western blot法分析妊娠期糖尿病和正常孕妇胎盘中SHBG及PI3K/Akt胰岛素抵抗传导通路相关因子的表达。选择在中国医科大学附属盛京医院产科确诊、定期产前检查、单胎且分娩女婴并经GDM饮食治疗使血糖控制良好的A1级GDM孕妇50例纳入本研究【筛选标准为24～28周时行口服75g葡萄糖耐量试(OGTT),诊断界值为空腹、服糖后1h和2h血糖分别为5.1mmol/L、10.0mmol/L和8.5mmol/L,超过界值1项及以上异常者诊断为GDM】,并以同期住院正常足月、妊娠同期OGTT阴性、单胎且分娩女婴并有定期产前检查的住院50例健康孕妇为健康对照组。任何有妊娠期高血压,哮喘,关节炎,先兆子痫,孕前糖尿病和大血管并发症等合并症的孕妇被排除在外。2、采用含不同浓度的胰岛素的RPMI1640培养基作用于胎盘滋养层细胞,用葡萄糖-己糖激酶法检测上清中葡萄糖含量,并用CCK8检测不同时间、不同胰岛素浓度细胞生存率,结合葡萄糖消耗量及细胞生存率确定产生胰岛素抵抗最佳胰岛素作用浓度及作用时间;并以油红及HE染色观察细胞形态变化;模型建立后再次用葡萄糖-己糖激酶法检测不同作用时间上清中葡萄糖含量,以确定胰岛素抵抗模型持续时间。3、向构建的胰岛素模型细胞转染过表达SHBG,用Real-Time PCR及Western blot法检测SHBG、GLUT1、GLUT3、GLUT4、PI3K、IRS1、IRS2在正常细胞、模型细胞、转染后的各组细胞的表达并分析相关性;用葡萄糖-己糖激酶法检测葡萄糖消耗量,观察转染过表达SHBG对胰岛素抵抗模型细胞胰岛素抵抗的影响;对各组细胞进行免疫荧光染色,观察SHBG、GLUT1、GLUT3、GLUT4、PI3K、IRS1、IRS2在细胞内的蛋白表达情况;采用CCK8进行增殖实验,观察转染过表达SHBG质粒对HTR8-SVneo细胞增殖的影响;采用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测转染SHBG质粒后,分析各组细胞凋亡指数,对其差异进行统计学分析。结果:1、妊娠期糖尿病组较正常组SHBG的mRNA及蛋白表达水平显著PI3K/Akt胰岛素抵抗传导通路相关因子除GLUT1显著升高以外,GLUT3、GLUT4、IRS1、IRS2、PI3K较正常组均显著下降,与正常组相比差异有统计学意义(p<0.05)SHBG mRNA表达水平与IRS1、IRS2、PI3Kp85α有显著正相关关系(p<0.05)。2、HTR8/SVneo细胞在胰岛素浓度为10^-7mol/L,作用时间为48h,葡萄糖消耗量最小,建立胰岛素抵抗模型细胞;模型细胞与正常细胞相比增殖减少,脂滴明显增多;模型建立后在60h内,胰岛素抵抗仍然存在。3、胰岛素抵抗模型组细胞SHBG的表达较对照组显著降低,转染过表达SHBG后,随着SHBG表达的升高,除GLUT1 mRNA和蛋白水平显著下降外(p<0.05),GLUT3、GLUT4、IRS1、IRS2、PI3K的表达均显著上升(p<0.05);转染SHBG组细胞上清中葡萄糖含量为4.61±0.63(mol·L-1),转染阴性对照组细胞上清中葡萄糖含量为6.15±0.08(mol·L-1),转染SHBG组葡萄糖含量显著低于转染阴性对照组(p<0.05);转染SHBG组细胞增殖率为0.713±0.050,转染阴性对照组为0.457±0.028(p<0.05)但二组细胞组凋亡率未见明显差异;对照组细胞中SHBG分布于细胞膜及细胞浆,转染SHBG组细胞中SHBG向细胞膜聚集;对照组细胞中IRS-1主要分布于细胞核,胰岛素抵抗模型组细胞中IRS-1的分布向胞浆转移,转染SHBG组细胞中,IRS-1重新向细胞核聚集。结论:1、本实验通过阳离子脂质体成功介导了SHBG转染胰岛素抵抗模型细胞。2、在胰岛素抵抗模型细胞中SHBG低表达,GLUT-1高表达,其余PI3K/AKT胰岛素通路相关因子表达降低。3、转染的过表达的SHBG抑制GLUT-1 mRNA和蛋白的表达,促进GLUT-3、GLUT-4、IRS-1、IRS-2、PI3K-p85 mRNA和蛋白的表达。4、在胰岛素抵抗细胞模型中,SHBG与GLUT-3、GLUT-4、IRS-1、IRS-2、PI3K-p85α正相关,SHBG与GLUT-1负相关。5、SHBG在HTR8-SVneo中分布于细胞膜和细胞浆中,SHBG表达量越高,越向细胞膜聚集。6、胰岛素可刺激IRS-1由细胞核向细胞浆释放,转染过表达SHBG可以使IRS-1重新细胞核聚集。7、在胰岛素抵抗模型细胞中转染过表达SHBG,可以有效促进细胞增殖。8、在胰岛素抵抗模型细胞中转染过表达SHBG,可以抑制早期凋亡,但不影响总凋亡率。9、在胰岛素抵抗模型细胞中转染过表达SHBG,可显著提高细胞葡萄糖代谢水平。

摘要译文

关键词：

妊娠期糖尿病; 胰岛素抵抗; 性激素结合球蛋白; 胎盘; 胰岛素抵抗模型; PI3K/AKT通路

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

妇产科学

导师：

金镇

中图分类号：

R714.256[内分泌腺病及代谢病⑨]

学科分类号：

100208[妇产科学]