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蛋清肽结构鉴定与完整吸收的构效关系研究认领

被引量： 22

作者：

丁龙

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

本研究隶属于国家自然科学基金面上项目《基于Caco-2细胞模型的蛋清肽结构与完整吸收关系研究》（31271907）和《基于Caco-2细胞膜和大鼠外翻肠囊模型的蛋清源活性寡肽完整吸收途径及机制研究》（31771985）。食源性生物活性肽因其良好的生物活性及营养、无毒副作用而受到广泛关注,但是,受到小肠吸收与生物利用率的影响,通过体外方法鉴定的食源性生物活性肽并不一定具有体内生物活性。因为,不同于内源性生物活性肽,许多食源性生物活性肽如ACE抑制肽等要在体内发挥生物活性,需要在经口摄入以后克服胃肠道酶降解和小肠上皮吸收渗透屏障,以完整的形式被小肠上皮吸收进入体内,随血液循环到达作用靶点,并累积到一定的量。其中,胃肠道消化酶的降解和小肠上皮的吸收渗透是主要限制因素。目前,鉴定得到的食源性生物活性肽多为含3～10个氨基酸残基的寡肽,而寡肽的小肠上皮吸收特性和吸收机制尚不明确。本文从蛋清源寡肽入手,利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型,研究蛋清源寡肽的刷状缘膜酶降解与完整吸收特性,通过末端FITC修饰和氨基酸替换,研究末端氨基酸对寡肽完整吸收的影响,并进行系统的构效关系分析,明确寡肽的疏水性参数和分子量与完整吸收的相关关系,阐释寡肽完整吸收的可能机制。主要研究内容和结果如下:（1）利用Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊模型研究蛋清蛋白模拟胃肠道消化水解物混合肽对刷状缘膜酶的降解与完整吸收情况,利用Q Exactive质谱对蛋清源刷状缘膜酶降解肽和完整吸收肽进行结构鉴定,并对鉴定得到的肽序列进行统计分析。结果发现,外翻大鼠肠囊对蛋清肽的降解作用大于Caco-2细胞单层膜,但是,分别有56条和28条分子量低于1000 Da且主要来自于卵白蛋白和卵转铁蛋白的蛋清肽能够被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊完整吸收,表明能被Caco-2细胞单层膜完整吸收的蛋清源寡肽数量要远大于外翻大鼠肠囊。另外,分析发现,有LGAKDSTRT、VNDLQGKTS、DGSRQPVDN、GKKDPVLKD共4条蛋清源寡肽能同时被Caco-2细胞单层膜和外翻大鼠肠囊2种模型完整吸收。（2）利用模拟胃肠道消化体系和Caco-2细胞单层膜模型,研究蛋清源ACE抑制肽TNGIIR在胃肠道消化酶和刷状缘膜酶作用下的降解以及完整吸收情况。结果发现,分别有5.87%±1.92%和17.17%±0.64%的TNGIIR被模拟胃肠道消化酶和刷状缘膜酶降解。但是,TNGIIR仍能被Caco-2细胞单层膜完整吸收,其正向吸收和反向外排的Papp值分别为（4.92±0.40）×10-6 cm/s和（5.99±0.27）×10-6cm/s,且只有细胞松弛素D能够显著改变TNGIIR的吸收率,说明TNGIIR在Caco-2细胞单层膜的完整吸收机制可能为受紧密连接调控的细胞旁路途径。（3）测定了末端FITC修饰对RVPSL、RVPSP和VPP在Caco-2细胞单层膜完整吸收的影响。结果发现,FITC-RVPSL和RVPSLK-FITC的Papp值分别为（0.88±0.11）×10-6 cm/s和（1.43±0.15）×10-6 cm/s,FITC-RVPSP和RVPSPK-FITC的Papp值分别为（0.66±0.10）×10-6 cm/s和（2.37±0.01）×10-6 cm/s,而FITC-VPP和VPPK-FITC的Papp值分别为（4.68±0.08）×10-6 cm/s和（3.25±0.08）×10-6 cm/s,说明RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率大于其N末端FITC修饰肽,而VPP的C末端FITC修饰后在Caco-2细胞单层膜的吸收率小于其N末端FITC修饰肽。RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率小于其N末端FITC修饰肽,而VPP的C末端FITC修饰后对刷状缘膜酶的降解率却大于其N末端FITC修饰肽。渥曼青霉素能显著降低RVPSL和RVPSP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收,却对VPP的N末端和C末端FITC修饰肽均无显著影响,细胞松弛素D能显著增大RVPSL和RVPSP的N末端FITC修饰肽和VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收率,但对RVPSL和RVPSP的C末端FITC修饰肽无显著影响,说明RVPSL和RVPSP的N末端修饰肽可能是通过细胞旁路和胞吞作用两种途径被吸收,而C末端修饰肽则可能主要通过胞吞途径被吸收。但是,不同于RVPSL和RVPSP,VPP的N末端和C末端FITC修饰肽的吸收机制均为细胞旁路。另外,圆二色谱结果显示,寡肽的二级结构与其在Caco-2细胞单层膜的完整吸收无关。（4）利用氨基酸替换法人工设计了78条以Ala为基本骨架但具有不同N末端或C末端氨基酸残基的四肽和五肽,固相合成后,测定其在Caco-2细胞单层膜的完整吸收情况。结果发现,根据吸收率的大小,可以将78条寡肽分成良好吸收肽、中等吸收肽、低吸收肽和难吸收或不能吸收肽4个等级。其中,N末端为Leu、Pro、Ile、Cys、Met、Val和C末端为Val的四肽,以及N末端或C末端为Tyr的五肽,都具有非常高的吸收率,其Papp值均大于10×10-6 cm/s,N末端为Glu、Asn、Thr或C末端为Lys、Asp、Arg的四肽或五肽的吸收率也较高,其Papp值范围为1×10-6 cm/s10×10-6 cm/s。另外,N末端氨基酸残基替换后的四肽和五肽的吸收率普遍高于C末端氨基酸替换肽,说明N末端氨基酸残基对寡肽在Caco-2细胞膜的吸收的影响作用更大。（5）统计分析了40条具有不同N末端氨基酸残基寡肽的疏水性参数log D和分子量MW与表观渗透系数之间的关系。结果发现,除去吸收率为零的寡肽,依据log D和MW对寡肽吸收率的影响,可以将寡肽分成良好吸收肽、中等吸收肽和低吸收肽3个等级。其中,在良好吸收肽中,Papp值范围为5×10-6 cm/s40×10-6 cm/s,log Papp与log D呈正向线性关系,与log MW呈负向线性关系;在中等吸收肽中,Papp值范围为0.25×10-6 cm/s5×10-6 cm/s,log Papp与log D及log MW均呈负向线性关系;而在低吸收肽中,Papp值范围为0～0.25×10-6 cm/s,log Papp与log D及log MW均呈正向线性关系。另外,经过分析发现,寡肽在Caco-2细胞单层膜可能存在两种或三种吸收途径,其中一种为受紧密连接调控的细胞旁路途径,另一种或两种则为寡肽转运载体或者胞吞途径。

摘要译文

关键词：

蛋清; 寡肽; 吸收; 构效关系; 吸收机制

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

食品科学与工程

导师：

刘静波

中图分类号：

TS201.2[食品化学]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083201[食品科学]