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星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道调节线粒体功能参与帕金森病的发生认领

被引量： 2

作者：

胡兆丽

学位授予单位：

南京医科大学

摘要：

帕金森病（Parkinson’s disease,PD）发病率仅次于阿尔茨海默病,是全球第二大衰老相关的神经退行性病变。PD呈慢性、进行性发展,其主要的临床症状表现为:静止性震颤、运动迟缓、肌强直、步态障碍等。随着疾病的发展,非运动症状如失眠、情感淡漠、抑郁及认知障碍逐渐占居主导地位,造成沉重的社会负担。PD患者中脑黑质区（Substantia nigra,SN）多巴胺能神经元进行性缺失,伴随纹状体多巴胺（Dopamine,DA）耗竭,尚存的DA能神经元中出现Lewy小体（lewy body,LB）,以上为PD的主要病理学标志。现阶段临床上PD的治疗策略为左旋多巴（1evodopa,L-DOPA）替代治疗,尽管能够缓解大多数PD患者的症状,但却无法阻止DA能神经元进行性死亡的病理进程,长期应用还会产生运动障碍等严重并发症。近年来大量的研究表明,PD是环境因素、遗传因素和衰老长期共同作用的结果。已提出的PD发病机制主要包括兴奋性毒性、线粒体功能障碍、炎症反应、氧化应激和错误折叠蛋白处理障碍等。然而根据目前提出的假说而研发的多种药物如NMDA受体拮抗剂、抗氧化剂及凋亡抑制剂等神经保护剂在临床研究中并未显现有效的神经保护作用。因此,全面深入地了解帕金森病的发病机制,将有助于寻找减缓或阻止帕金森病的治疗方法。PD病理机制尚未明了,目前认为包括帕金森在内的神经退行性疾病的一个共同特征是神经炎症反应的发生,表现为神经胶质细胞,主要是小胶质细胞和星形胶质细胞的激活。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞,具有广泛的生理功能,主要包括调节神经元的外部环境、给予神经元营养、能量代谢支持等。在PD发病脑区的微环境中,神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞所形成的神经网络存在动态平衡,当星形胶质细胞表型从静息态转变为激活状态,星形胶质细胞会根据其周围环境多样性信号改变自身表型,其功能包括分泌促炎因子、参与细胞修复和细胞外基质重塑的神经营养物质的释放等一系列细胞内分子事件。在此过程中星形胶质细胞呈现出高的能量需求,因此,其线粒体功能正常与否关系到星形胶质细胞正常功能的维持,且这种星形胶质细胞功能稳态在帕金森等神经退行性疾病的发生及疾病进展过程中起到重要作用。所以,加强对星形胶质细胞在PD中的功能探讨,通过靶向星形胶质细胞的线粒体功能来调节星形胶质细胞的活动是干预PD的一种新思路。ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channel,K-ATP通道）是一类耦联细胞代谢和电活动、非电压依赖性的钾离子通道。K-ATP通道在与帕金森病相关的黑质、纹状体脑区高度表达,并参与调节多种与PD相关的神经递质如DA和谷氨酸（glutamate,Glu）的释放。包括本实验室在内多个研究小组前期研究显示,K-ATP通道开放剂对多种毒素引起的PD样神经损伤具有神经保护作用,其机制包括恢复线粒体功能、抗兴奋性毒性、抗凋亡和抑制神经炎症等。表达Kir6.2/SUR1的DA神经元对鱼藤酮毒性最敏感。Kir6.2敲除能取消MPTP联合丙磺舒所致PD慢性模型小鼠黑质DA神经元的损伤作用。本课题组近期报道了表达在小胶质细胞的Kir6.1/K-ATP通道参与调节小胶质细胞表型变化,在PD进程中发挥神经保护作用。以上研究结果提示,K-ATP通道可能是研发理想神经保护剂的重要靶标。中枢神经系统广泛分布的星形胶质细胞主要表达Kir6.1构成的K-ATP通道,但是该通道是否参与PD的发生发展及其具体机制尚不清楚。另外线粒体膜上也有该类型通道的分布,且文献及本实验室前期研究显示线粒体K-ATP通道可能在PD毒素所致的星形胶质细胞的功能损伤过程中发挥保护作用,但具体的调节机制亦未明了。基于此,本文第一部分工作应用Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠:分别制备LPS急性PD模型、MPTP急性模型、MPTP/p慢性模型,观察星形胶质细胞Kir6.1基因敲除对不同PD模型小鼠中脑神经损伤的影响。研究结果表明:星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加重上述多种PD动物模型中脑PD样神经损伤,促进中脑多种应激反应通路的激活,包括内质网应激反应、炎症反应、凋亡通路的激活以及自噬通路的抑制。由于第一部分研究结果显示PD动物模型中星形胶质细胞Kir6.1基因敲除引起中脑广泛的应激反应,我们推测可能是星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加剧星形胶质细胞在病理条件下的功能改变,削弱了其对抗损伤的能力。近年来的研究表明星形胶质细胞线粒体功能障碍在PD的发生发展中发挥关键作用,我们实验室前期研究发现开放K-ATP通道能够维持星形胶质细胞线粒体功能,抑制其凋亡,提示星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道可能通过调控线粒体功能稳态参与PD的发生。因此第二部分工作首先培养两基因型小鼠的中脑原代星形胶质细胞,研究在PD细胞模型中星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对其自身功能及对线粒体功能稳态的影响及机制。结果表明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失加重MPP+刺激引起的星形胶质细胞损伤、线粒体功能受损,促进炎症反应。进一步研究发现星形胶质细胞尤其是线粒体上的Kir6.1敲除,抑制线粒体自噬,加重线粒体功能紊乱诱发星形胶质细胞的毒性效应,进而导致了中脑神经元的损伤。第一部分星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD动物模型小鼠神经损伤中的作用目的:应用星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除小鼠,研究星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD模型小鼠中脑神经损伤中的作用。方法:应用3-4月龄Kir6.1loxp/loxp和Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+雄性小鼠,制备PD急性模型(（1）LPS急性PD模型:根据paximas和watson图谱定位中脑黑质坐标位点,注射5.0μg LPS（2）MPTP急性模型:腹腔注射MPTP 20 mg/kg,一日4次,两次之间间隔1小时)。应用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）及离子钙结合蛋白l（ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba-1）进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对PD急性模型中脑神经损伤的影响。应用3-4月龄两基因型雄性小鼠,制备PD慢性模型（皮下注射MPTP,20 mg/kg。1小时后腹腔注射丙磺舒,250 mg/kg,3.5日一次,连续5周）。应用转棒、爬杆和开场等行为学检测手段评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对MPTP/p所致小鼠运动功能的影响。分别应用TH免疫组化染色法、尼氏染色法,联合应用体视学计数法对小鼠中脑SNc DA能神经元数量进行定量;应用多巴胺转运体（dopamine transportor,DAT）免疫组化染色法对小鼠中脑SNc区、及纹状体DA能神经元数量及功能进行评价。应用GFAP、Iba-1进行免疫组织化学染色,联合应用体视学计数法对小鼠黑质区DA能神经元、星形胶质细胞和小胶质进行定量,评价中脑黑质区胶质细胞增殖活化情况。应用高效液相色谱法（Highperfomance Liquid Chromatography,HPLC）检测MPTP在两种基因型小鼠体内代谢情况,以评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除对MPTP在小鼠体内代谢的影响。应用ELISA检测小鼠血清及中脑组织中MPTP代谢酶──单胺氧化酶B（MAO-B）的酶活性,以评价星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除在MPTP/p慢性模型中对MAO-B活性的影响。应用HPLC法检测两种基因型小鼠造模后纹状体内及海马内单胺类递质和氨基酸类神经递质水平变化。应用ELISA法检测小鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。应用Western blot检测造模后两种基因型小鼠中脑黑质区应激反应,包括炎症反应相关蛋白、内质网应激相关蛋白、自噬相关蛋白、凋亡通路相关蛋白。另外还检测中脑组织中三种营养因子BDNF、GDNF、FGF-2的蛋白水平。结果:1)基础状态下,两种基因型小鼠中脑SNc区TH阳性神经元数目无显著性差异。LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区TH阳性神经元均显著性丢失,且Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠的丢失更为显著。2)基础状态下,两种因型小鼠中脑SNc区胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）数目无显著性差异。LPS及MPTP急性模型制备后,两种基因型小鼠SNc区胶质细胞均显著活化,且条敲组小鼠的胶质细胞增殖活化更为明显。3)MPTP在两种基因型小鼠的血浆、纹状体、肝、肾内代谢均无显著差异。4)MPTP/p慢性造模后,MAO-B在两种基因型小鼠的血清、中脑组织的酶活性无显著差异。5)基础状态下,两种基因型小鼠纹状体DA及其代谢产物水平无显著差异;MPTP/p慢性模型制备成功后,Kir6.1loxp/loxpGFAPcre/+小鼠纹状体内DA含量降低更为显著。另外无论是基础状态下还是MPTP/p模型,两种基因型小鼠纹状体的氨基酸类神经递质水平都无显著差异。6)MPTP/p慢性模型制备后,星形胶质细胞Kir6.1的缺失加重小鼠的运动协调能力障碍,但不影响小鼠的运动速度。7)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除加重MPTP/p慢性模型小鼠中脑SNc DA能神经元丢失,加重SNc胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）的增殖和活化。8)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除促进MPTP/p慢性模型小鼠血清中IL-1β的分泌。9)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除上调小鼠中脑的炎症反应相关蛋白表达:p65、NLRP3、Caspase-1、pro IL-1β和IL-1β。10)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除增加小鼠中脑的内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase12的表达水平。11)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除抑制小鼠中脑的自噬通路。12)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的敲除显著上调小鼠中脑的促凋亡通路相关蛋白Bax、AIF的蛋白表达,显著下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。13)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道的缺失不影响小鼠中脑BDNF、GDNF、FGF-2的蛋白表达。结论:1)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道敲除加重PD动物模型加重中脑DA能神经元的丢失,促进星形胶质细胞和小胶质细胞的增殖活化。2)星形胶质细胞Kir6.1基因敲除促进MPTP/p诱导的中脑内多种细胞应激反应。3)星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在PD发生发展中发挥保护作用。第二部分星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道对线粒体功能的调节作用及其机制研究目的:阐明星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道在线粒体功能稳态中的作用及其机制方法:应用出生3天内的两基因型新生小鼠,提取中脑原代星形胶质细胞进行离体培养。给予上述两种星形胶质细胞100μM MPP十刺激,收集细胞上清及细胞用于后续实验。应用DHE（Dihydroethidium,二氢乙啶）荧光探针检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞内ROS生成的影响。应用LDH试剂盒检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞LDH释放的影响。应用细胞免疫荧光、Western blot方法检测星形胶质细胞Kir6.1/K-ATP通道缺失对MPP+介导的原代星形胶质细胞凋亡的影响。应用Western blot检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白水平和营养因子BDNF、GDNF、FGF2转录水平的影响。应用Western blot方法检测MPP+对两种基因型星形胶质细胞中炎症信号（P65、NLRP3、补体C3、Caspase-1）水平的影响。

摘要译文

关键词：

星形胶质细胞; 帕金森病; Kir6.1/K-ATP通道; mito-K-ATP; 线粒体; 线粒体自噬; 神经炎症; DA能神经元

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

药理学

导师：

胡刚

中图分类号：

R742.5[震颤麻痹综合征⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]