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新型喹唑啉类化合物的抗肿瘤活性、作用机理及其在细胞成像中的应用认领

被引量： 3

作者：

张娅玲

学位授予单位：

陕西师范大学

摘要：

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一,其治疗、治愈一直是科学界和医学界的研究热点。临床应用的喹唑啉类靶向抗肿瘤药物,如吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼等在肿瘤初期治疗时疗效显著,但是用药一段时间后均会产生诸如耐药、肝毒性等问题,因此亟待开发出高药效、低毒性、低耐药性的新型抗肿瘤药物。本研究在了解肿瘤流行现状及其治疗方式,学习表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）及其相关信号通路和线粒体以及它们在肿瘤发生发展过程中的调控作用,研究已上市和临床试验中的喹唑啉类抗肿瘤药物的现状及其作用机理,总结喹唑啉类抗肿瘤化合物的结构修饰、构效关系研究进展及其在生物检测应用的基础上,对本实验室已有化合物的抗肿瘤活性、作用机理、构效关系及在细胞成像中的应用进行了研究。主要研究内容及结果如下:1.应用噻唑蓝（Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT）法检测了本实验室合成的A-G七类共158个新化合物对五种人肿瘤细胞的增殖抑制活性,结果表明七类化合物的肿瘤增殖抑制活性具有明显的差别,其中,6-（5-取代呋喃-2-基）喹唑啉类化合物（A类）、4-(4-（E）-丙烯基苯氨基)喹唑啉类化合物（B类）、6,7-双（吗啉基烷氧基）喹唑啉类化合物（C类）、6-氟喹唑啉类化合物（D类）、靛红杂合喹唑啉类化合物（F类）活性较强,1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）杂合喹唑啉类化合物（E类）和其他杂环类新化合物（G类）活性较弱。特别是A类化合物中的4-(3-氯-4-（3-氟苄氧基）苯基氨基)-6-（5-羟甲基呋喃-2-基）喹唑啉（T5）、B类化合物中的4-(4-（E）-（丙烯-1-基）苯基氨基)-6,7-二-（3-吗啉基丙氧基）喹唑啉（T25）、C类化合物中的4-(3-氯-4-（3-氟苄氧基）苯基氨基)-6,7-二-（3-吗啉基丙氧基）喹唑啉（T31）和D类化合物中的4-(3-氯-4-（3-氟苄氧基）苯基氨基)-6-氟-7-（哌嗪-1-基）喹唑啉（T44）能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,并呈现较好的剂量依赖效应。T5作用于SW480、A431、A549和NCI-H1975细胞时,IC50分别为 5.58、3.64、7.35 和 3.01 μM;T25 作用于 SW480、A431、A549和 NCI-H1975 细胞时,IC-50分别为 6.08、1.35、8.83 和 5.53 μM;T31 作用于 SW480、A431、A549、HCC827 和 NCI-H1975 细胞时,IC50分别为 3.27、1.31、1.65、0.37和 4.87μM;T44 作用于 SW480、A431、A549、HCC827 和 NCI-H1975 细胞时,IC50分别为1.75、0.98、1.55、0.71和2.30 μM。构效关系分析表明B类化合物6、7位双吗啉基取代、C类化合物4位3-氯-4-（3-氟苄氧基）取代、D类化合物7位哌嗪基或者1-（二乙氨基乙基）哌嗪基取代时,有利于增强化合物抗肿瘤细胞增殖活性;F类化合物中将靛红结构单元导入呋喃基的5位,且靛红基1位N用二乙氨基乙基修饰时能有效增强化合物抗肿瘤细胞增殖的活性;与本研究中测试的其他几类杂环（吡咯并三嗪、芳氨代-α-呋喃葡萄糖、苦参碱）衍生物相比,含喹唑啉母核的化合物具有较高的抗肿瘤细胞增殖活性。2.用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）法检测了抑制肿瘤细胞增殖高活性的化合物对野生型EGFR（Wild Type EGFR,EGFRwt）的抑制活性,结果表明部分受试化合物对EGFRwt具有一定的靶向抑制作用,特别是化合物T5、T25和T31能够显著抑制EGFRwt的活性,IC50分别为5.06,20.72和6.99 nM。通过Sybyl软件进行分子对接,分析了 T5、T25和T31与EGFR之间的作用方式,结果显示T5、T25分别与EGFR之间形成2个氢键;T31与EGFRwt之间形成4个氢键,其中的2个氢键位于EGFR天冬氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（Asp-Phe-Gly,DFG）结构域。以A549为受试细胞,应用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）分析了 T5、T25和T31对EGFR及其下游相关信号通路的影响,研究结果表明它们均是通过抑制EGF/EGFR信号通路的活化,进而阻断下游信号通路PI3K/AKT和RAS-RAF-MEK-ERK,发挥其抑制A549细胞增殖的作用;应用商业化测试方法检测了化合物T31对突变型EGFR活性的抑制作用,结果表明T31能够显著抑制EGFRT790M的活性,IC50为9.28 nM。细胞凋亡及细胞周期分析结果表明T31能够诱导A549细胞凋亡并将细胞周期阻滞在G0/G1期。以上结果说明T5、T25是有潜力的EGFRwt抑制剂,T31是有潜力的EGFRwt和EGFRT790M抑制剂。3.基于受试化合物对A549细胞增殖的抑制活性,通过Sybyl软件构建了CoMFA和CoMSIA模型,进行了靶向EGFR类（A、B、C类）化合物的三维定量构效关系分析（the Three-Dimensional Quantitative Structure Activity Relationship,3D-QSAR）,结果表明喹唑啉4、6、7位的适当修饰如增大4位苯氨基取代基体积及苯氨基电正性,增加4位氢键供体及疏水性基团;增加6、7位的电负性以及取代基的体积,减少6位取代基氢键供体,增加6位疏水性基团、增加7位氢键受体及亲水性基团,有利于提高化合物的抗肿瘤活性。4.通过ELISA法检测了 E类化合物对EGFRwt活性的抑制作用,结果表明该类化合物中的4-（3-氯-4-氟苯基氨基）-6-甲氧基-7-(3-(（2R,3R,4R,5S）-2-羟甲基-3,4,5-三羟基-1-哌啶基)丙氧基)喹唑啉（T73）能够有效抑制EGFRwt的活性,IC50为1.79 nM;已有结果表明T73对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性,IC50为0.39 μM。这种结果预示着通过对T73的结构改造,进而改善化合物的生物利用度,有望开发出靶向EGFRwt和α-葡萄糖苷酶的双靶点抑制剂,为糖尿病携带肿瘤患者的治疗带来新的希望。5.用ELISA法和WB分别检测了 D类化合物中的化合物T44对EGFRwt活性和EGFR信号通路的抑制作用,结果表明T44对EGFR没有明显抑制作用。应用人蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinase,PTK）磷酸化抗体阵列进行了激酶谱筛选,评价了 T44对71中PTK活性的影响,结果表明T44不是靶向作用于EGFR,有可能靶向作用于ALK、ACK1、BTK、ABL1或者BMX蛋白发挥抗肿瘤作用,此结果需要进一步研究。细胞凋亡、细胞周期和细胞克隆形成实验表明T44能够诱导A549细胞凋亡,将该细胞周期阻滞在G0/G1期,也能够显著抑制A549细胞克隆的形成。T44光学性能的研究结果表明其具有良好的荧光性能。显微成像分析其在细胞内成像及亚细胞定位的结果表明T44能够迅速被细胞摄取,在细胞中发出蓝色荧光并定位于细胞线粒体。利用流式细胞仪结合相应标记试剂和WB研究了 T44对线粒体功能的影响,结果显示T44能够降低线粒体膜电位,升高线粒体内活性氧的水平;能够降低caspase9、caspase3的表达水平,升高cleaved caspase 9、cleaved caspase 3的表达水平。移植A549瘤细胞的斑马鱼模型检测结果表明T44能够抑制斑马鱼体内A549移植瘤的增殖与迁移。以上结果说明T44主要是通过调控线粒体功能,发挥其抗肿瘤及诱导细胞凋亡的作用,是有潜力的抗肿瘤候选化合物。6.对D类化合物中的4-(3-氯-4-（3-氟苄氧基）苯基氨基)-6-氟-7-(4-（2-甲氧基乙基）哌嗪-1-基)喹唑啉（T52）的光学性质进行了研究,结果表明T52具有良好的荧光性能。MTT法分析结果表明T52细胞毒性较低,作用于多种细胞（A549、Hela、LO2、HepG2、MCF-7和HEK293A）时,对细胞增殖没有明显的影响。显微成像研究结果表明T52能够对细胞荧光成像且定位于细胞线粒体。以上结果说明T52在细胞成像方面具有一定的应用潜力。同时利用晶体X-射线衍射法对T52的晶体结构进行了分析,该结果将有助于T52后续进一步的研究。

摘要译文

关键词：

表皮生长因子受体(EGFR); 线粒体; 喹唑啉类化合物; 抗肿瘤活性; 抗肿瘤机理

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

有机化学

导师：

李宝林

中图分类号：

TQ463.5;R96[药理学]

学科分类号：

100109[医学药理学];100603[中西医结合药学];100706[药理学]