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转录因子C/EBPβ在糖尿病性心肌病中的作用及机制研究认领

被引量： 1

作者：

帖媛媛

学位授予单位：

山东大学

摘要：

研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病导致的一种严重的心血管并发症,是由代谢紊乱引起的除外冠状动脉性心脏病、高血压性心脏病、心脏瓣膜病等其他心脏病变的心肌疾病。目前,DCM已成为导致糖尿病患者死亡的主要并发症,占总死亡率70%左右。早期DCM患者临床症状不显著,超声心动图检测可显示心脏舒张功能受损,病程后期可出现收缩功能障碍及充血性心力衰竭。研究表明,心室重构是导致DCM主要的病理机制,表现为心肌间质纤维化、心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡。近年来,DCM的发病机制尚未完全明确,心肌细胞代谢紊乱、肾素-血管紧张素系统(RAS)激活、氧化应激、自噬、钙稳态失衡、胰岛素抵抗及炎症反应等被认为参与其发生和发展。其中RAS激活是诱导DCM心室结构重构的重要发病机制。经典的RAS主要通过调节外周血管收缩阻力来调控血容量及血压。近年来的研究发现,多种组织中存在RAS成员的表达,尤其是心脏内局部RAS的激活,可引起心脏结构重塑。RAS中重要的成员包括血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)、血管紧张素Ⅱ 2型受体(AT2受体)、血管紧张素转化酶2(ACE2)、血管紧张素(1-7)及血管紧张素(1-7)的Mas受体。RAS的平衡主要由ACE-AngⅡ-AT1受体轴和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴来调节。AngⅡ作为RAS的核心成员,在DCM的胶原合成、细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等过程都起到重要作用。众多研究表明缬沙坦作为AT1受体拮抗剂具有改善DCM心室重构的作用。另一些研究表明,ACE2作为ACE的同工酶降解AngⅡ生成Ang(1-7),过表达ACE2基因明显改善AngⅡ诱导的心室肥厚及纤维化且作用优于ARB。然而ACE2作为一种酶易被降解,具有不稳定的特点,因此,通过促进ACE2合成来抑制DCM心室重构有望成为新的治疗方式。转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(C/EBPβ)是结合于DNA增强子的反式作用因子,属于亮氨酸拉链转录因子家族。C/EBPβ通过调节多种靶基因转录活性,影响细胞增殖与分化,调控细胞周期,调节癌细胞的生成与凋亡等。有研究表明,降低C/EBPβ表达水平,可以增加多种心肌肥厚相关基因的表达,如GATA相关蛋白4、a-肌球蛋白重链、肌钙蛋白T和T-box转录因子5等。在我们之前的研究中发现,C/EBPβ可结合于ACE2基因启动子序列并调控ACE2蛋白的表达,过表达C/EBPβ可上调动脉粥样硬化(AS)斑块内ACE2的表达,从而降低斑块易损性,抑制AS的进展。然而,对于C/EBPβ在DCM中的作用尚未报道。因此,本研究应用注射链脲佐菌素(STZ)的实验方法,建立1型糖尿病动物模型,探讨C/EBPβ在DCM中的表达及对RAS和心室重构的作用。研究目的1.研究C/EBPβ及RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达水平;2.研究C/EBPβ基因过表达、干扰及缬沙坦给药对糖尿病小鼠心脏功能、心肌纤维化及心肌细胞凋亡的影响;3.比较过表达C/EBPβ与缬沙坦对DCM的作用。研究方法1.构建小鼠C/EBPβ慢病毒载体设计3对小鼠C/EBPβ基因siRNA序列,转染至小鼠原代心肌成纤维细胞(CFs)中,采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)筛选出RNA及蛋白水平干扰效率最显著的siRNA序列,由公司依据所筛最优序列构建合成慢病毒载体,其中包含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,C/EBPβ过表达慢病毒由公司直接包装合成。2.糖尿病动物的建立及分组将100只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(体重23±5g)随机分为糖尿病组(80只)和正常对照组(20只)。糖尿病组小鼠给予连续5天的腹腔内STZ-柠檬酸缓冲液注射,STZ剂量为50mg/kg,正常对照组(Control组)仅注射等体积柠檬酸缓冲液。一周后连续3天检测糖尿病组随机血糖,血糖大于16.7mmol/l被认为1型糖尿病模型已成功建立。于造模成功12周后,将糖尿病组小鼠随机进行分组,设立4组:糖尿病空载体对照组(DM + sh-N.C.)、糖尿病+ C/EBPβ基因过表达慢病毒组(DM + C/EBPβ)、糖尿病+ C/EBPβ基因干扰慢病毒组(DM+sh-C/EBPβ)、糖尿病+缬沙坦组(DM+valsartan)。其中空载体、过表达及干扰慢病毒转染通过小鼠尾静脉注射的方法,转染病毒滴度为每只小鼠1×107UT/30μl。缬沙坦组的糖尿病小鼠采用灌胃的方式给药,给药量为30mg/kg。小鼠于慢病毒转染和给药4周后行安乐死,留取心脏组织及血液并适当保存。实验期间采用尾静脉取血的方法,分别于STZ注射0周、1周、12周及16周取材前检测糖尿病小鼠随机血糖水平。采用鼠尾血压计于STZ注射0周、16周检测各组小鼠心率及血压水平。3.心脏功能检测STZ注射16周后,使用高分辨率小动物超声仪对小鼠心脏室壁厚度、左心室收缩及舒张功能进行检测和评价。4.组织形态学及免疫组织化学染色取材后的小鼠心脏组织使用4%多聚甲醛进行浸泡固定,并制备4.5μm石蜡切片,用于H&E染色及Masson染色。前者可观察心脏组织大体形态、心肌细胞形态、大小及排列,后者用于观察心肌间质胶原含量。应用免疫组织化学染色法,检测C/EBPβ、ACE2、ACE、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平。5.血清酶联免疫吸附测定(ELISA)使用ELISA检测AngⅡ、Ang(1-7)在心肌组织及血清中表达水平,检测白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的血清含量。6.蛋白质印迹实验(Western blot)提取小鼠左室心肌组织蛋白,用Western blot法检测C/EBPβ、ACE2、ACE、AT1受体、AT2受体、Mas受体、胶原 I、胶原 IⅢ、TGF-β1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax的表达水平。7.原代CFs的分离与培养本实验使用的原代CFs提取自1-3天的C57BL/6J乳鼠心脏并使用含10%胎牛血清的DMEM进行培养。8.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)应用实时荧光定量qPCR技术测定siRNA干预后原代CFs中C/EBPβ的mRNA表达水平。9.统计学分析应用SPSS v18.0软件对所有数据结果进行统计分析,多组间比较采用one-way ANOVA检验,数据显示使用均数±标准差,p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.C/EBPβ干预对糖尿病小鼠的血糖及血压水平无显著影响所有糖尿病小鼠随机血糖均显著高于正常对照小鼠,而4组糖尿病小鼠间血糖无统计学差异。各组小鼠之间血压亦无显著的统计学改变。2.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心室肥大和心功能障碍STZ注射16周后,糖尿病小鼠心脏重量(HW)和心身重量比(HW/BW)增加,心脏大小明显增加,H&E染色观察发现心肌结构异常,心肌细胞肥大,排列紊乱。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达及缬沙坦给药组可显著改善心脏形态及心肌结构,并且C/EBPβ过表达的改善作用要优于缬沙坦组。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。与正常对照小鼠相比,4组糖尿病小鼠均出现不同程度的收缩与舒张功能障碍,其中左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS)和E/A显著降低,而左心室后壁厚度(LVPWd)增加,并且左心室舒张末内径(LVEDd)显著扩大。C/EBPβ过表达及缬沙坦治疗组可明显改善DCM的心功能异常,且C/EBPβ过表达作用更显著。C/EBPβ干扰组较空载体组无显著变化。3.C/EBPβ过表达显著改善糖尿病小鼠心肌组织纤维化心肌组织Masson染色显示,与正常组比,4组糖尿病小鼠间质中胶原表达显著增加,并且Western blot检测及免疫组织化学显示,心肌组织纤维化相关蛋白如胶原I、胶原Ⅱ和TGF-β1表达水平增加。与糖尿病空载体组比较,C/EBPβ基因过表达和缬沙坦治疗可以降低胶原的表达,而C/EBPβ干扰组无明显改变。Western blot检测显示,高血糖降低心肌组织MMP-2蛋白表达水平,C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗可以增加MMP-2的表达从而降解心肌间质的胶原,C/EBPβ干扰组MMP-2蛋白水平较空载体组无统计学差异。各组小鼠间MMP-9表达水平无明显差异。与缬沙坦治疗组相比,C/EBPβ过表达组抑制胶原表达和促进胶原降解的能力更为显著。4.C/EBPβ过表达抑制糖尿病小鼠心肌细胞凋亡和炎症因子的分泌与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中Bax/Bcl-2比值明显增加,提示心肌细胞凋亡水平增加。C/EBPβ过表达和缬沙坦治疗较糖尿病空载体处理比,可显著降低Bax/Bcl-2比值。有研究表明,AT2受体作为AngⅡ作用的另一受体,其表达水平的增加与细胞凋亡有关。相对于正常小鼠而言,糖尿病小鼠AT2受体明显增多。与糖尿病空载体组相比,增加C/EBPβ表达可以显著减少AT2受体的表达,而缬沙坦对AT2受体表达无明显作用。C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组无统计学差异。糖尿病小鼠血清IL-6和MCP-1水平明显增加。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达组和缬沙坦治疗组可以降低血清炎症因子的水平,C/EBPβ干扰组较糖尿病空载体组的炎症因子水平无明显变化。5.C/EBPβ蛋白在糖尿病小鼠心肌组织中呈低水平表达与正常组比,糖尿病空载体组的小鼠心脏组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显降低,C/EBPβ基因干扰慢病毒在C/EBPβ低水平表达的情况下不能进一步降低其表达,而过表达慢病毒可显著增加C/EBPβ蛋白表达。缬沙坦组C/EBPβ的表达较糖尿病空载体组无明显变化。6.C/EBPβ过表达上调糖尿病小鼠心肌组织中ACE2表达水平糖尿病空载体组心肌组织中的ACE2表达含量与正常组相比明显减少。与糖尿病空载体组相比,过表达C/EBPβ可以显著增加ACE2的表达,而C/EBPβ基因干扰组与缬沙坦治疗组ACE2表达含量无明显差别。7.C/EBPβ过表达降低糖尿病小鼠AngⅡ并增加Ang(1-7)含量糖尿病空载体组的小鼠心肌组织及血清中AngⅡ含量较正常组明显升高,而Ang(1-7)含量降低。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可降低AngⅡ含量并升高Ang(1-7)水平,而缬沙坦治疗可增加Ang(1-7)表达,但程度较C/EBPβ过表达低,并增加AngⅡ的含量。C/EBPβ干扰慢病毒处理较空载体组无明显变化。8.C/EBPβ过表达下调DCM心肌组织中ACE和AT1受体并上调Mas受体表达水平体内实验结果显示,高血糖上调ACE和AT1受体并下调Mas受体表达。与糖尿病空载体组相比,C/EBPβ过表达可逆转高血糖诱导的ACE、AT1受体及Mas受体表达变化,而缬沙坦处理后并无此作用。C/EBPβ干扰处理较空载体组无显著变化。研究结论1.1型糖尿病小鼠心肌组织中C/EBPβ蛋白表达水平明显减低;2.C/EBPβ基因过表达通过抑制心肌肥厚、纤维化、凋亡及炎症反应显著改善DCM心室重构及心功能;3.C/EBPβ基因过表达调控RAS主要成员在糖尿病小鼠心肌组织中的表达含量;4.C/EBPβ基因过表达对DCM的改善作用要明显优于缬沙坦治疗。研究背景糖尿病(DM)作为三大非传染性慢性疾病之一,已严重威胁人类健康,其致死率仅次于癌症、心血管疾病、感染及创伤等。1972年,Rubler等人发现一些心力衰竭患者除糖尿病之外并无其他致病因素,首次提出糖尿病性心肌病(DCM)这一概念。目前认为,DCM是在血糖升高的基础上,引起显著心脏结构改变和心功能减退,除外其他致心脏病变因素的心肌疾病。心室重构是DCM发生和发展的重要机制,研究表明,DM患者心脏重构的主要机制包括细胞内能量及物质代谢障碍,肾素-血管紧张素系统(RAS)过度激活,心脏微血管障碍及自主神经病变等。心肌组织的纤维化合并心肌细胞凋亡是DCM主要病理改变。

摘要译文

关键词：

糖尿病性心肌病; C/EBPβ; 肾素-血管紧张素系统; 心室重构; 缬沙坦; C/EBPβ; ACE2; 高糖刺激; 胶原合成; 细胞凋亡

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

内科学（心血管病）

导师：

张澄

中图分类号：

R587.2[糖尿病性昏迷及其他并发症⑨];R542.2[心肌疾病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]