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基于GC/MS和LC/MS技术的缺氧对乳腺癌细胞代谢影响的研究认领

被引量： 2

作者：

杨杰

学位授予单位：

军事科学院

摘要：

肿瘤细胞与其微环境的相互作用是肿瘤代谢重编程的一大重要特征,在影响肿瘤代谢的多种微环境中,缺氧是尤为重要的一个因素。缺氧是大部分实体瘤的共同特征,且在肿瘤代谢调控、侵袭、转移等各个方面均发挥着重要作用。对于缺氧对肿瘤代谢调控的研究,目前在基因组和转录组方面已有大量研究基础。缺氧会诱导缺氧诱导因子HIF的表达,HIF会调控多种代谢相关的基因和酶的表达进而影响肿瘤的代谢。而研究发现单纯地抑制HIF介导的通路,有时并不能抑制肿瘤的生长,即可能存在其他非HIF依赖的调控机制。已有研究发现了一些非HIF调控的基因及其调控机制,特别是某些显著变化的代谢物也会通过多种机制影响信号通路的传导进而参与缺氧应答。因而寻找致瘤代谢物为缺氧应答机制的研究提供了新的思路。代谢组学特别是同位素标记代谢组学,因其在代谢物及代谢通路分析方面的优势越来越被广泛地应用于肿瘤细胞代谢的研究中。目前,采用细胞代谢组学进行肿瘤缺氧的研究大多基于细胞及分子生物学的研究基础靶向地针对某一具体代谢物或者具体代谢路径进行下游验证研究,而对于整体代谢组的非靶向研究则相对较少。大量研究已表明代谢物也能参与信号通路及表观遗传的调控,进而诱发肿瘤的发生。因此对肿瘤细胞代谢组在特定条件下的组成和变化进行表征,有助于发现新的致瘤代谢物,为上游生物学研究提供新的方向。在此基础上利用稳定同位素标记的代谢组学方法,分析特定代谢物及相关通路的代谢变化,探索新的缺氧相关的代谢调控机制,为肿瘤发生发展的机制研究提供新的证据。本文主要以乳腺癌细胞为研究对象,采用基于GC/MS和LC/MS的非靶标代谢组学方法研究缺氧对细胞代谢的影响,筛选差异代谢物,发现显著变化的代谢通路,从而探究缺氧相关的代谢机制。进而建立基于GC/MS和LC/MS的同位素标记代谢组学方法,根据非靶标代谢组学的分析结果,靶向地分析中心碳代谢和谷氨酰胺回补路径相关的代谢变化,并与非靶标代谢组学结合更全面地分析缺氧对乳腺癌细胞代谢的影响。本研究工作主要包括四部分内容:第一部分,建立了基于GC/MS的细胞代谢组学方法,并以此分析了三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、ER+乳腺癌细胞MCF7和正常乳腺上皮细胞MCF10a在常氧和缺氧培养条件下细胞内代谢产物。结合多元统计分析,我们分别筛选出了33、26和17个组间差异代谢物,其中共同差异代谢物有6种,主要为氨基酸类。在缺氧条件下MDA-MB-231细胞有23种代谢物的相对含量显著降低,主要包括葡萄糖、PPP途径中间代谢产物、氨基酸（除丝氨酸外）及脂肪酸类;10种代谢物的相对含量显著增加,包括糖酵解和核苷酸中间代谢产物、丝氨酸、2-羟戊二酸、磷酰基乙醇胺和腐胺。MCF7细胞有21种代谢物的相对含量在缺氧的条件下显著降低,主要包括葡萄糖、TCA循环途径中间代谢产物、氨基酸及脂肪酸类;5种代谢物的相对含量在缺氧的条件下增加,包括糖酵解和核苷酸中间代谢产物及腐胺。MCF10a细胞则有17种差异代谢物的相对含量在低氧条件下显著降低,主要包括乳酸、柠檬酸、氨基酸及脂肪酸类。缺氧条件下,MDA-MB-231和MCF7细胞的糖酵解途径增强,TCA循环减弱;在MCF7和MCF10a细胞中均未筛选出显著变化的PPP途径的代谢产物;MCF10a对葡萄糖的利用减少,但与常氧组相比并没有显著差别。相比于MCF7和MCF10a,MDA-MB-231细胞在缺氧时其2-羟基戊二酸和丝氨酸的含量显著增高,PPP途径中间代谢产物的相对含量显著降低,推测可能与MDA-MB-231的高侵袭性和转移性相关。相比于正常乳腺上皮细胞MCF10a,乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7在缺氧时表现为典型的HIF1a调控相关的代谢变化。以上这些代谢变化的发生可能与缺氧环境适应及细胞生长维持的需要相关。第二部分,为进行全面的代谢组学分析,建立了基于LC/MS的细胞代谢组学方法。采用该方法我们初步探索了MDA-MB-231细胞在常氧和缺氧条件下细胞内代谢产物的变化。与基于GC/MS的研究结果相似,缺氧时糖酵解代谢产物6-磷酸葡萄糖显著增加,TCA循环代谢产物及某些氨基酸类显著降低。LC/MS检测到的代谢物多为极性和分子量稍大的代谢产物。除了糖酵解和TCA循环代谢产物及某些氨基酸类代谢物之外,我们还检测到核苷酸（如UMP,dCDP,XMP,GMP和ATP等）及核苷酸的衍生物（NAD+和NADP+）、辅酶A和脂类代谢物。因此基于LC/MS的代谢组学研究可以对GC/MS检测结果进行有效的验证和补充。第三部分,建立了基于GC/MS的同位素标记代谢组学方法,并根据基于GC/MS和LC/MS的非靶标研究结果,靶向地分析了MDA-MB-231和MCF7细胞在缺氧条件下葡萄糖代谢和谷氨酰胺回补反应相关的代谢通路的变化。通过在培养基中添加13C-葡萄糖来具体分析葡萄糖代谢变化,我们发现MDA-MB-231和MCF7细胞在缺氧条件下其TCA循环受到抑制。该结果与非靶标代谢组学研究结果一致。另外,我们发现在缺氧条件下,MDA-MB-231细胞内葡萄糖经PPP生成的丙酮酸增加,而在MCF7细胞中则未检测到这种显著变化。而在非靶标代谢组学研究部分,MDA-MB-231缺氧组的PPP中间代谢产物的相对含量是降低的,MCF7缺氧组则没有筛选到显著变化的PPP中间代谢产物。在缺氧条件下MDA-MB-231和MCF7 TCA循环中间代谢产物未标记率增加,表明非葡萄糖代谢通路增强。通过添加U-13C-谷氨酰胺作为底物,我们研究了缺氧条件下谷氨酰胺代谢路径的变化,发现MDA-MB-231和MCF7在缺氧条件下谷氨酰胺回补路径和还原性羧化作用增强。此外,苹果酸到丙酮酸的转化增强,表明苹果酸酶的表达可能发生了变化。基于GC/MS的同位素标记代谢组学研究结果结合非靶标代谢组学研究,充分证实了同位素标记代谢组学在具体代谢物及代谢通路分析方面的优势。第四部分,初步建立了基于LC/MS的同位素标记代谢组学方法。我们分别采用两种类型的质谱仪进行了数据采集,并对所得数据分别采用了不同的软件方法进行同位素标记代谢物的筛选。利用人工方法进行同位素标记代谢物的筛选,共得到同位素标记代谢物18个,包括糖酵解和TCA循环中间代谢产物及核苷酸类。根据α-酮戊二酸/谷氨酸/天冬氨酸/柠檬酸推测MDA-MB-231在缺氧条件下TCA循环和丙酮酸羧化作用减弱。采用软件进行同位素标记代谢物的自动筛选,正负离子模式分别筛选出53和36个同位素标记化合物,经统计分析得到12个差异代谢物,除了糖酵解中间代谢产物和核苷酸外,主要为脂类。对同位素标记代谢物的筛选,采用手动提取方式工作量太大且靶标性较强,易忽略潜在差异代谢物;采用自动筛选得到的代谢物多为脂类和核苷酸类,该类物质本身合成代谢反应较为复杂,因而其代谢通路的归属也较为困难。在以后的研究中可以有效地结合两种方式,以更加全面地筛选出同位素标记代谢物进行代谢通路的分析。

摘要译文

关键词：

肿瘤代谢; 缺氧; 代谢组学; 同位素标记代谢组学; GC/MS; LC/MS

学位年度：

2018

学位类型：

博士

学科专业：

药物分析学

导师：

颜贤忠董方霆

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨];O657.63[质谱分析⑨]

学科分类号：

1002[临床医学];070302[分析化学];081704[应用化学];081706[分子化工]