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鸡骨香的化学成分及生物活性研究认领

作者：

田金龙

学位授予单位：

沈阳药科大学

摘要：

鸡骨香(Croton Geisel.),大戟科(Euphorbiaceae)巴豆属(Croton)植物,广泛分布于我国广东、海南、广西、云南等地,以及东南亚其他各国,别名千人打、土沉香、黄牛香、鸡角香、透地龙等。原植物为矮小灌木,高30～50cm,根粗壮,可作药用,性苦、辛、温;具有行气止痛、祛风消肿、燥湿的功效,可用于风湿痹痛、腰腿痛、胃痛、咽喉肿痛、黄疸、疝痛、蛇咬伤、跌打肿痛等,广西地方中药材标准1990年版收载品种。其在临床上应用的复方制剂有:胃得康片、复方风湿宁片、复方风湿宁注射液及少林跌打止痛膏等。本文利用萃取,硅胶柱色谱、开放ODS柱色谱及反相制备液相等手段从鸡骨香根部的75%乙醇提取物中,分离得到44个化合物,通过分析化合物的理化性质并结合高分辨质谱、一维、二维核磁共振谱、圆二色谱、计算旋光、计算核磁和计算ECD等方法,鉴定了全部化合物的结构,分别为:crassifolius A(1),crassifolius B(2),crassifolius C(3),cassifolius D(4),crassifolius E(5),6S-OH-cyperenoic acid(6),crassifoliuspyran A(7),crassifoliuspyran B(8),crassifterpenoid A(9),teucvin(10),isoteucvin(11),1,4-methano-3-benzoxepin-2(1H)-one(12),penduliflaworosin(13),chettaphanin Ⅰ(14),crassifolin H(15),crassifoliusin A(16),methyl 9-(furan-3-yl)-2,7,13-trimethy l-4-oxo-10-oxatricyclo[5.3.3.01,6]trideca-5,8-diene-2-carboxy la te(17),crassifolin F(18),crassifolin D(19),crassifolin C(20),crassifolin J(21),crassifolin L(22),neoclerodan-5,10-en-19,6b;20,12-diolide(23),4-methoxy-6-nonyl-2-pyrone(24),crotonpyrones B(25),crotonpyrones A(26),cyperenoic acid(27),cyperenol(28),methyl cyperenoate(29),spathulenol(30),isodactyloxene A(31),1β,11-dihydroxy-5-eudesmene(32),(+)-4-hydroxy-4,7-dimethyl-α-tetralone(33),6,7,8-trimethoxycoumarin(34),methyl ferulate(35),(2E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propenoic acid(36),Des-O-methyllasiodiplodin(37),(2E,6E,12E)-3,7,13-trimethyl-10-(1-methylethenyl)-2,6,12-cyclotetradecatrien-1-ol(38),(-)-cembrene A(39),7-keto-sitosterol(40),7-ketositosterol(41),aleuritolic acid(42),acetyl aleuritolic acid(43),lupeol(44)。其中9个化合物(1-9)为新化合物,化合物24为新天然产物,4个化合物(33,37,39,40)为首次从巴豆属植物中分离得到。对分离得到的克罗烷型和哈立烷型二萜(1-3,10-23)进行了体外肝癌细胞毒活性测试,结果显示化合物1对Hep3B显示出了较好的体外细胞毒活性,其IC50值为17.91μM,应用AO染色观察细胞核的形态学变化,发现染色质固缩并形成凋亡小体。Western blot结果表明,化合物1可以引起pro-caspase 3表达下降以及剪切形式的caspase 3表达的升高,并且PARP被剪切。以上实验均证明化合物1可以诱导Hep3B细胞凋亡。对分离得到的5个吡喃酮类化合物(7-8,24-26)进行了体外细胞毒活性测试,结果显示化合物7对HepG2有较好的活性(IC50为9.8 μM),进一步研究发现化合物7在10μM时可以明显引起HepG2细胞的皱缩、染色质聚集并有凋亡小体形成。在Annexin V-FITC/PI双染下化合物7可以显著性的诱导细胞凋亡,7可以上调活化型PARP的表达。Western blot的方法检测了化合物7作用于Ras/Raf/ERK通路的情况,结果显示,化合物7可以显著下调Ras,Raf和ERK的表达。并且实验发现化合物7可以上调HepG2中p53的表达,最终研究表明化合物7作用于p53调节的Ras/Raf/ERK通路来诱导HepG2的凋亡。应用雅致小克银汉霉Cunninghamella elegans AS 3.2028对鸡骨香中分离得到的倍半萜类化合物Methyl cyperenoate(29)进行生物转化研究,利用萃取、开放ODS柱色谱及反相制备液相等手段,分离得8个methyl cyperenoate(JGX-29)的生物转化产物,通过分析化合物的理化性质并结合质谱、红外光谱、旋光谱、一维、二维核磁共振谱及圆二色谱等方法,鉴定了全部化合物的结构,分别为:methyl cyperenoate-9-dien-8-one(ZH-6),9S-hydroxy-methyl cyperenoate(ZH-7),8R-hydroxy methyl-cyperenoate(ZH-8),8S-hydroxy-methyl cyperenoate(ZH-9),13R-hydroxy-methyl cyperenoate(ZH-10),10S-hydroxy-methyl cyperenoate(ZH-11),7S-hydroxy-methyl cyperenoate(ZH-12),methyl cyperenoate-8-one(ZH-13),其中8个生物转化产物均为新化合物。对化合物ZH 1-5(合作分离得到的新的转化产物)进行细胞毒和抗血管生成实验研究,结果显示转化产物ZH 1-5均无细胞毒活性,且ZH 1-4有显著的抗血管生成作用。ZH 6-13的体外抗血小板聚集活性实验显示ZH 6-8均有较好的抑制血小板聚集活性且其活性结果与阳性药阿司匹林相当。且ZH 6-8较底物MC能更好的延长APTT、TT和PT。实验表明ZH 6-8对外周血淋巴细胞无毒性作用,进一步体内转基因斑马鱼实验显示,在浓度为100μg/mL时,化合物ZH-6对斑马鱼血栓的生成具有抑制作用。在本文中,应用HGE-UHPLC-MS/MS方法提取和定量9个二萜类化合物,包括:teucvin(10),1,4-methano-3-benzoxepin-2(1H)-one(12).chettaphanin-Ⅰ(14),Methyl 9-(furan-3-yl)-2,7,13-trimethyl-4-oxo-l 0-oxatricyclo[5.3.3.01,6]trideca-5,8-diene-2-carboxyla te(17),crassifolin F(18),crassifolin D(19),crassifolin C(20),crassifolin L(22),neoclerodan-5,10-en-19,6b;20,12-diolide(23)。由于鸡骨香药材的质量控制相关研究目前正处于初步发展阶段,该方法可用于鸡骨香中二萜的含量测定研究,为鸡骨香的质量控制研究提供参考依据。

摘要译文

关键词：

鸡骨香; 二萜; 倍半萜; 细胞毒; 生物转化; 含量测定

学位年度：

2017

学位类型：

博士

学科专业：

天然药物化学

导师：

宋少江

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]

D O I：

10.27330/d.cnki.gsyyu.2017.000046