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茉莉酸信号途径参与调控沉香倍半萜生物合成的分子机制研究认领

被引量： 22

作者：

廖永翠

学位授予单位：

北京协和医学院

摘要：

茉莉酸(JA)及其衍生物统称为茉莉素(JAs),广泛存在于植物中的一类植物内源激素,对植物生长和发育具有广泛的生理效应；同时可作为内源信号分子参与植物的抗逆反应。长期以来,对JA信号途径的机制及功能的研究一直是生命科学研究的热点之一。白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg)为瑞香科(Thymelaeceae)沉香属(Aquilaria)或拟沉香属(Gyrinops)常绿乔木,是我国生产传统名贵中药材沉香的基原植物,同时也是中药沉香的正品来源。作为传统中药,沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效。白木香只有在受到伤害时才能形成沉香,我们已证明了沉香是白木香防御反应的产物。沉香主要由倍半萜类和苯乙基色酮类衍生物两种类型的化合物组成。其中,倍半萜类化合物的生物合成途径研究相对比较清晰,但对于它的调控途径不清楚。前期研究中发现,外源茉莉酸甲酯(MeJA)能显著诱导白木香树和愈伤组织中沉香倍半萜物质的合成与积累。这些结果表明,JA与沉香倍半萜的形成有关；但它是否直接参与调控以及如何调控沉香倍半萜的生物合成还不清楚。本文从分子层面上研究JA信号途径与沉香倍半萜形成的关系,为揭示白木香结香机理提供基础数据。本研究获得了以下主要结果：1、JA信号分子能调控沉香倍半萜的合成。结合白木香转录组基因表达谱数据与荧光定量PCR (qRT-PCR)检测分析,发现JA信号途径中的关键基因显著响应外界胁迫,且均属于响应早期伤害的基因。热激处理能诱导白木香悬浮细胞中内源激素JA和沉香倍半萜(a-愈创木烯,α-蛇麻烯和δ-愈创木烯)的快速大量合成；JA合成抑制剂能抑制JA和倍半萜的合成,在热处理后12h以内未检测到沉香倍半萜成分,24 h后才检测到少量倍半萜生成。2、首次从白木香中,也是沉香属植物中分离并克隆了JA信号途径中的5个关键基因(LOX、CPI1、NINJA、JAZ和MYC2) 的 cDNA全长序列。分别命名为,AsLOX1、AsCOI1、AsNINJA1、AsJAZ1和AsMYC2,为倍半萜合成过程中JA信号途径的研究奠定基础。3、基本明确了白木香AsJAZ1基因功能,过表达AsJAZ1基因能抑制拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPSll的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的负调控因子之一。通过亚细胞定位分析,AsJAZ1基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以叶中的表达量最高。将白木香AsJAZ1基因转入野生型拟南芥中,该基因过表达抑制了拟南芥中TPS21和TPS11基因的表达。4、基本明确了白木香AsMYC2基因功能,AsMYC2基因过表达能正调控拟南芥倍半萜合酶基因TPS21和TPS11的表达,该基因极有可能是调控沉香倍半萜合酶基因表达的正调控转录因子。亚细胞定位分析表明,AsMYC2基因编码的蛋白定位于细胞核中,属于核蛋白；基因组织表达模式分析表明,该基因在根、茎、叶和枝中均有表达,但以茎和根中的表达量最高；AsMYC2基因过表达能正调控野生型拟南芥倍半萜合酶基因：VPS21和TPS11的表达；在拟南芥myc2-2突变体中,AsMYC2基因过表达能一定程度上恢复对TPS21和TPS11基因表达的调控作用。5.明确了白木香AsJAZ1与AsMYC2白间存在体外相互作用。通过基因重组技术,成功的构建了AsJAZl基因和AsMYC2基因的原核表达载体,在大肠杆菌中成功的诱导了His-AsJAZ1(?)GST-AsMYC2融合蛋白的表达,并进行了蛋白纯化,高质量蛋白的获得为今后蛋白多克隆抗体的制备提供材料基础。利用pull-down技术验证了两蛋白间相互作用,为研究JA信号途径参与调控沉香倍半萜的生物合成机制奠定基础。通过研究基本证实了JA信号途径参与沉香倍半萜生物合成的调控过程。本研究也是首次在沉香属植物中,针对沉香倍半萜生物合成调控机制上开展的关于JA信号分子通路较系统的研究,将对其它信号分子通路的研究有参考价值,为全面解析伤害诱导白木香防御反应形成沉香的调控机制提供分子依据。

摘要译文

关键词：

白木香; 沉香; 倍半萜; JA信号途径; 调控机制

学位年度：

2015

学位类型：

博士

学科专业：

生药学

导师：

魏建和

中图分类号：

S567.19;S567.1[木本⑨]

学科分类号：

0901[作物学];100810[分子生药学]

D O I：

10.7666/d.Y2818105