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刺激响应性聚乙二醇—聚乳酸共聚羟基乙酸—聚谷氨酸杂化核纳米粒的研究认领

作者：

徐荷林

学位授予单位：

沈阳药科大学

摘要：

当前生物医药领域关于生物可降解、生物相容性的两亲性高分子材料主要聚焦在聚乙二醇(PEG)化的聚乳酸共聚羟基乙酸类、聚氨基酸类,这两类材料已广泛用于制备聚合物胶束。然而,这两类材料制备的胶束用于药物传递存在载药量低,体内稳定性差的缺陷。基于聚乙二醇、聚乳酸共聚羟基乙酸(PLGA)、功能性聚谷氨酸(PGlu)为片段构建的三嵌段聚合物有希望解决胶束制剂的上述缺陷。本研究以聚乙二醇单甲醚为亲水嵌段、聚乳酸共聚羟基乙酸为疏水嵌段、以及聚谷氨酸为功能性嵌段,构建新型聚乙二醇单甲醚-聚乳酸共聚羟基乙酸-聚谷氨酸三嵌段聚合物;并对该类三嵌段聚合物性质、自组装特性、载药潜力,以及载药纳米粒体内生物学行为进行研究、探讨。本研究首先以聚乙二醇单甲醚5000(简称mPEG5k)为引发剂,合成了两嵌段聚乙二醇单甲醚5000-聚乳酸共聚羟基乙酸聚合物(mPEG5k-PLGA);以端氨基化的mPEG5k-PLGA为引发剂,引发L-谷氨酸-5-苄酯N-羧基环内酸酐开环聚合,合成三嵌段聚乙二醇单甲醚5000-聚乳酸共聚羟基乙酸聚合物-聚谷氨酸苄酯(mPEG5k-PLGA-PBZL)聚合物。最后,三嵌段mPEG5k-PLGA-PBZL聚合物经脱除保护基团——苄基,合成三嵌段聚乙二醇单甲醚5000-聚乳酸共聚羟基乙酸-聚谷氨酸(mPEG5k-PLGA-PGlu)聚合物。通过控制各步聚合反应的投料比,合成了不同嵌段分子量的两嵌段mPEG5k-PLGA和三嵌段mPEG5k-PLGA-PGlu聚合物,并利用凝胶渗透色谱(GPC)、氢核磁共振波谱(1H-NMR)、红外光谱(FT-IR)等分析手段对各步产物进行了结构表征与确证。以芘荧光探针法对不同嵌段分子量的两嵌段mPEG5k-PLGA,以及三嵌段mPEG5k-PLGA-PGlu聚合物的临界聚集浓度(CAC)进行了测定与比较,实验表明随着聚合物中疏水性PLGA段分子量增大,CAC值降低;三嵌段mPEG5k-PLGA-PGlu较相应两嵌段mPEG5k-PLGA聚合物,CAC稍有增大。透射电镜表明mPEG5k-PLGA20.5k-PGlu7.9k易组装成核-壳纳米粒;进一步1H-NMR分析表明,该核-壳纳米粒由PLGA与PGlu链段构成杂化核,亲水mPEG链构成外壳。因杂化核内PGlu侧链羧基解离,产生静电排斥力,杂化核呈疏松的膨胀状态,使得该核-壳纳米粒具有较大的水化粒径(Dh=218nm),和负的Zeta电位(-25.4mV)。基于聚合物纳米粒在不同pH条件下,展现出不同粒径,对光具有透过性差异,以透光率法对mPEG5k-PLGA20.5k-PGlu7.9k嵌段聚合物pH响应性进行研究;表明该嵌段聚合物能特异性在pH5-6范围内响应。圆二色谱技术表明其pH响应是因为PGlu链二级结构pH依赖性地由水溶性的“无序卷曲”状向疏水性的α-螺旋状转变所致。GPC对聚合物纳米粒体外酶降解进行研究;表明蛋白酶k能快速地使mPEG5k-PLGA20.5k-PGlu7.9k聚合物降解成多个碎片。本研究以盐酸阿霉素(DOX)为模型药物。经静电作用和药物自身π-π堆积作用,DOX很容易包裹在mPEG5k-PLGA20.5k-PGlu7.9k纳米粒中,获得高载药量,并且随处方中药物/聚合物比例增大,载药量(DL)增大,最高载药量可高达25.0%,包封率在80-97%。载药后,因纳米粒杂化核内电荷排斥力减小,使得载药纳米粒粒径随DL增大,而减小;载药纳米粒负的Zeta电位随DL增大,而增大;以mPEG5k-PLGA20.5k-PGlu7.9k为材料,控制药物/聚合物比为1:5,制备最优载药杂化核纳米粒(DOX-NPs),该载药纳米粒平均粒径为107.2nm,Zeta电位-17.54 mV,载药量为14.75%,包封率为90.12%。在pH7.4介质中,DOX-NPs具有明显的缓释性能,72h释放约70%;而在pH5.0的介质中,因杂化核PGlu侧链羧基质子化、静电作用消失以及纳米粒结构破坏,DOX-NPs呈现快速pH-响应性药物释放行为,24h释放高达70%;因蛋白酶k能快速降解纳米粒结构,在加入蛋白酶k的pH7.4和pH5.0介质中,DOX-NPs展现出明显的酶响应性药物释放行为,6h分别释放60%和80%。以低浓度的羟丙基-β-环糊精(1%,w/v)加入DOX-NPs水溶液中作为冻干保护剂,所获冻干粉末能快速地复溶分散,复溶后粒径变化不超过10nm。以人乳腺癌细胞MCF-7和耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADR为细胞模型,对上述DOX-NPs体外细胞毒性,细胞摄取以及摄取机制进行研究。结果表明:对MCF-7细胞,DOX-NPs较阿霉素溶液剂(DOX-S)具有更强的增殖抑制作用,其IC50比DOX-S低约2-3倍;对耐药的MCF-7/ADR细胞,DOX-NPs细胞增殖抑制作用更为明显,其IC50 比 DOX-S低约3-4倍,表明DOX-NPs具有克服多药耐药的潜能;MCF-7细胞对DOX-NPs摄取量随时间延长而增大,至少需要4h才在细胞核内出现强的药物荧光;DOX-NPs以小凹蛋白介导和胞饮的内吞机制被耐药的MCF-7/ADR细胞摄取,进入细胞深部,绕开了细胞膜表面的多药耐药蛋白,能部分克服肿瘤细胞的多药耐药。对上述DOX-NPs在体内药动学,药效学,组织分布,急性毒性进行研究,结果表明DOX-NPs能短暂性延长DOX体内的循环时间,减慢其体内清除速率,其在大鼠体内的 AUC(0-∞)、t1/2α和 t1/2β 分别为 DOX-S 的 3.13、1.36 和 8.67 倍,而 CL 和 Vss分别为DOX-S的0.31和0.52倍;荷MDA-MB-435S瘤裸鼠药效实验表明DOX-NPs抑瘤率为45.4%,高于DOX-S的25.6%,更好地抑制肿瘤生长;荷MDA-MB-435S瘤裸鼠组织分布表明:给药2h后,与DOX-S相比,DOX-NPs明显减小了药物在心、脾、肾、肝、肺中分布;给药8h后,DOX-NPs在肿瘤组织中药物分布较DOX-S提高2倍:健康昆明小鼠急性毒性研究表明:以10mg/kg剂量单次给药后,给DOX-NPs小鼠血液中没有出现心脏毒性相关酶异常,以及心脏组织病理切片显示未见病理性损伤;而给DOX-S小鼠则出现明显的心脏毒性相关酶——乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸磷酸激酶(CPK),异常升高,以及组织病理切片显示心肌细胞出现明显的病理性断裂。

摘要译文

关键词：

聚乙二醇-聚乳酸共聚羟基乙酸-聚谷氨酸; 静电作用; 自组装; 杂化核; 纳米粒; 盐酸阿霉素; 缓释; pH-响应性; 酶-响应性; 高载药量; 体内评价

学位年度：

2015

学位类型：

博士

学科专业：

药剂学

导师：

唐星蔡翠芳

中图分类号：

TB383.1;TQ460.4[原料及辅助物料]

学科分类号：

081702[化学工艺];1007[药学]

D O I：

10.27330/d.cnki.gsyyu.2015.000028